克服光學衍射極限,觀察到亞細胞尺度的生物結構和變化過程一直是生命科學研究的目標之一,也是超分辨顯微鏡誕生的目的所在。隨著現代顯微成像技術的發展和不斷突破,超分辨顯微成像大家庭也一直在補充新鮮血液。不過,這些形形色色的技術各自也都存在著不足:譬如前面幾期中我們提到的 PALM/ STORM/DNA-PAINT 等單分子定位技術都需要長時間的多幀采集,并需要高功率激發光。這意味著它們在很大程度上不適合對活細胞進行成像。
在超分辨顯微成像專題的最后一期中,我們將為大家介紹一種完全不同的,適合活細胞的超分辨顯微技術——結構光照明顯微成像(Structure Illumination Microscopy, SIM)。
SIM 的原理
SIM 最早是在2005年由 Mats Gustafsson 開發并提出的,其基本原理是基于莫爾條紋(Moire pattern)——一種常用于產生光學錯覺的效應。
莫爾條紋:由兩個空間頻率相近的周期性光柵圖形疊加而形成的光學條紋。當兩條線或兩個物體之間以恒定的角度和頻率發生干涉,而人眼無法分辨這兩條線或兩個物體時,只能看到干涉的花紋。
這個概念聽起來有點高深,但其實莫爾條紋是一種我們在生活中隨處可見的現象(圖1)。大家可以翻翻看自己穿著條紋襯衫的照片,說不定就能看到莫爾條紋的身影哦。
圖1 生活中的莫爾條紋
從圖2我們可以更加直觀地了解莫爾條紋是如何用于顯示高頻信息的:當兩個小尺寸(高頻)網格疊加覆蓋在最右邊的圖像中時,它們之間發生干涉后就會顯示一個較大尺寸(低頻)的網格,這個網格會包含兩個較小網格的信息。
圖2 兩個相互成一定角度重疊的細網格相互干涉形成的莫爾條紋。From Wikimedia commons
在實際使用時,通過在照明光路中插入一個結構光的發生裝置(如光柵,空間光調制器,或者數字微鏡陣列DMD等),照明光受到調制后,形成亮度規律性變化的圖案,然后經物鏡投影在樣品上,調制光所產生的熒光信號再被相機接收。通過移動和旋轉照明圖案使其覆蓋樣本的各個區域,并將拍攝的多幅圖像用軟件進行組合和重建,就可以得到該樣品的超分辨率圖像了。由于需要組合多個圖像,SIM 的成像過程是需要一定時間的,不過遠比STORM這樣的單分子定位超分辨顯微技術要快許多。
還有一種速度更快的SIM技術——iSIM(Instant SIM)。它的前身是多焦點SIM(multifocal SIM,mSIM)。mSIM結合了共聚焦和結構光照明——不是用線,而是用多個稀疏的光點排列成圖案進行照明(圖2)。這些焦點由微透鏡形成,并與發射光路徑上的針孔相結合,達到光學切片的效果。微透鏡陣列可以對來自每個照明焦點圖像進行2倍的光學收縮,然后通過振鏡將帶有圖案的激發光投射到整個樣品上進行成像。Curd 等人在文章詳細說明了構建iSIM系統的過程(Curd et al., 2015.)。
iSIM 不同于 mSIM 的地方在于,它可以通過微透鏡陣列和掃描振鏡直接組合多個位置的圖像,不需要通過軟件,從而大大提高了速度,并減少了相機噪聲的影響。與PALM/STORM 等技術相比,iSIM 的速度能提高100倍。與其它結構光照明技術相比,iSIM 對樣品的穿透能力要高上10倍,并且具有比轉盤共聚焦更好的光學切片能力,這樣一來,后期反卷積處理的效果也非常好。
圖3 產生多焦點激發的會聚微透鏡陣列。激發樣品后,用與微透鏡陣列匹配的針孔陣列抑制非焦平面的雜散光。借助于第二個微透鏡陣列,每個針孔發射的熒光可實現2倍收縮。振鏡用于光柵多焦激發和和收集多焦發射光,在每次曝光期間產生超分辨率圖像(為清晰起見,本圖僅顯示部分振鏡)。(York et al., 2013)
左:原始圖像。右:左圖的動畫示意。
SIM 的應用
SIM 和 iSIM 可以將傳統光學顯微鏡的分辨率極限降低一半,更重要的是能夠對活細胞進行超分辨成像。iSIM 能夠以高達 100Hz 的頻率采集圖像,并且具有更好的光學切片能力。這使得 iSIM 能夠在使用傳統熒光染料的同時,對生物結構內部進行3維時間序列的超分辨成像。從而讓研究人員可以突破光學分辨率極限,觀察細胞和組織內微觀結構的動態過程。
圖4將 iSIM 與其他活細胞成像技術(轉盤共聚焦,線掃描共聚焦)的分辨率進行了比較。這個樣品的挑戰是線粒體內部空隙中沒有 Mcherry 表達,因此只有用 iSIM 才能實現超分辨(圖c中用白色箭頭所示)。
圖4 表達 TFAM-GFP(綠色)和 Tom20-mCherry(紫色)的MRL-TR轉化人肺成纖維活體細胞。圖a-c用iSIM拍攝,d-f用轉盤共聚焦拍攝,g-i用線掃描共聚焦顯微鏡拍攝。(York et al., 2013)
圖a, d, g所示為3 μm體素的最大強度投影(XY),高倍圖顯示的為白色箭頭指示區域在對應時間點的圖像。
圖b, e, h: a, d, g高倍圖中白色矩形區域的高倍放大。Scalebars: 0.5μm
圖c, f, i: a, d, g中黃線指示的~270 nm切片的軸向(ZY)視圖。Scalebars: 1μm
內質網的運動和生長非常迅速,新的內質網小管的形成和生長發生在約100ms的時間尺度上,iSIM 能夠非常清楚地捕捉到內質網的生長過程(圖5)。
圖5 iSIM拍攝的內質網動力學圖像(100Hz)(Yorket al., 2013)
A:200個時間序列中的第一張圖像,顯示了在MRL-TR轉化人肺成纖維細胞內GFP-Sec61A標記的內質網。Scalebar:10 μm
B:A中白色大矩形區域的放大圖像。白色箭頭指示內質網小管的生長,藍色指示內質網小管的重塑。Scalebar:5 μm
C:A中白色小矩形的放大圖像,140ms內新的內質網小管形成過程。Scalebar:200 nm
使用iSIM,York等人還成功地對3日齡斑馬魚紅細胞的結構進行了活體成像(圖6),避免了由于運動導致的圖像模糊。展示出了對活樣品生物結構進行無創成像的能力。
圖6 上:100個2D圖像(2673ms)的最大強度投影。顯示3日齡斑馬魚胚胎腦部血細胞中GFP標記的微管。成像深度:20μm;運動方向:從左到右,清晰的細胞邊界顯示沒有由于運動導致的圖像模糊。Scalebar:10μm
下:上圖中紅色方框在特定時間的圖像。黃色箭頭:同一細胞末端的“尾巴”結構;黃色小箭頭:尾部的微管;紅色箭頭:細胞內的微管。Scalebar:2μm。
適合 SIM 的科學相機
SIM 常用于進行高時間分辨率的活體超分辨成像,高速的 sCMOS相機是它們的最佳搭檔。另一方面,由于曝光時間短,SIM對相機采集信號的能力要求也比較高。
因此,背照式sCMOS相機是一個不錯的選擇,如Prime BSI,Prime BSI express,Prime 95B等。95%量子效率帶來的高靈敏度,再加上低讀出噪聲,可以在提高采集速度的同時保證圖片信噪比。另外,均勻的背景對SIM和iSIM這種靠結構光照明來實現超分辨成像的技術來說也很重要。
審核編輯 :李倩
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原文標題:結構光照明顯微成像(SIM)
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