一種大視場結構照明顯微鏡設計

導讀

結構照明顯微鏡（SIM）具有成像速度快、侵入性小、分辨率超高、具有光學切片成像能力等優點，在生物學研究中得到了廣泛的應用。然而，使用空間光調制器（SLM）進行條紋投影的傳統SIM通常具有有限的成像視野。

主要內容

本文報告了一種大視場SIM技術，該技術結合了用于條紋圖案投影的2D光柵和用于選擇條紋方向和數字相移的SLM。該方法基于UPOLabs的HDSLM80R空間光調制器搭建的安裝圖如下圖所示。

大視場SIM的示意圖

該SIM技術打破了數字投影器件限制條紋數的瓶頸，同時保持了傳統SIM高速（數字）相移的優勢，避免了SLM的像素化和色散效應，該技術可廣泛應用于生物學、化學和工業領域。

光學顯微鏡是許多領域不可或缺的成像工具。然而，光學顯微鏡的空間分辨率受衍射限制在λ/2，一般為200nm。在過去的三十年中，超分辨率（SR）顯微鏡方法，包括定位顯微鏡（PALM/STORM）、受激發射耗盡顯微鏡（STED）和結構照明顯微鏡（SIM），以將空間分辨率提高到數十或幾納米。在SR技術中，SIM因其高速和最小的侵入性而脫穎而出，因此最適合對活體樣本進行成像。SIM通過記錄用周期性圖案照亮樣品而產生的摩爾紋圖案來提供SR圖像，從而將通常無法檢測到的樣品高頻降頻到系統帶寬中。

使用 SLM 和針孔的 SI 條紋方向選擇濾波。在將二元光柵加載到SLM之前和（b）之后對±1st光譜（a）進行針孔濾波。將二進制光柵加載到 SLM 之前和之后的光譜 （c）。分別在將二元光柵加載到SLM之前和（f）之后產生的照明模式（e）。

如今，SIM通常使用數字微鏡器件（DMD）或空間光調制器（SLM）來生成和切換不同方向的結構化照明模式并執行相移。使用這種投影設備可以實現高達每秒數十幀（FPS） 的高幀率。二維光柵的投影產生1760條條紋（是傳統SIM的3倍），避免了SLM/DMD的像素化和色散效應。此外，SLM用于選擇SI條紋方向并執行相移，從而顯著提高了成像速度。該論文通過對熒光珠和百合柱頭進行成像，實驗證明了所提出的大視野SIM的特征。

圖 4.在直徑為 240 nm 的熒光珠上進行寬視場和 SIM 成像。（a）熒光珠的寬視場（左）和SIM圖像（右）。放大了不同位置的五個感興趣區域（ROIs），以便更好地比較寬視場和 SIM成像模式 [在面板（b）和（c）的頂部]。（b）沿穿過兩個相鄰珠子的線的強度分布，如（2）[見圖4（b）]。（c）空間分辨率統計。

本研究提出了一種大視場SIM設備，該設備使用二維光柵和SLM來獲取大視場、超分辨率成像。首先，由于光柵投影的視場大，其吞吐量是傳統SIM卡的三倍。其次，所提出的配備振幅光柵的配置與多色SIM成像兼容，避免了DMD的像素化和色散效應。與現有的光柵投影SIM卡相比，該方法使用SLM進行條紋方向旋轉和相移。因此，它具有卓越的成像速度。所提方法的當前幀速率受CMOS相機的限制，其幀速率為23FPS。在目前的實現中，結構化圖案的方向被限制在兩個正交方向上，從而影響了空間分辨率和成像速度。在所提出的方案中，可以使用可能產生更多衍射方向的達曼光柵在三個或更多方向上產生結構照明，從而實現更各向同性的分辨率增強。然而，所提出的方法也存在缺點：首先，當兩個條紋方向之一下降時，照明強度會損失50%;其次，由于涉及物理光柵和SLM，該方法具有相對復雜的配置。

審核編輯：湯梓紅