淺談超分辨光學成像

分辨光學定義及應用

分辨光學成像特指分辨率打破了光學顯微鏡分辨率極限(200nm)的顯微鏡，技術原理主要有受激發射損耗顯微鏡技術和光激活定位顯微鏡技術。

管中亦可窺豹——受激發射損耗顯微鏡

傳統光學顯微鏡采用寬場成像的方式，照明光一次照亮整個成像范圍，然后用相機對整個成像范圍進行曝光成像，一次獲得整幅圖像?！肮苤懈Q豹”型的掃描成像則有所不同，照明光聚焦在樣品上，形成一個極小的光點——也就是所謂的“管”，每次只對光點對應的區域進行成像;當我們改變光點的位置，使它依次掃遍整個樣品，也就獲得了一幅完整的圖像。有人要問了，即使采用“管中窺豹”的方式，每次聚焦的光點依然受到衍射極限限制，系統分辨能力比起所謂的寬場成像沒有提高，掃描過程又增加了系統的復雜度，不是自找麻煩嗎?Stefan W. Hell的回答很簡單：只要設法縮小“管中窺豹”的“管”，就能提高系統的分辨能力，實現超分辨。

通常的熒光成像是這樣的：熒光分子在吸收了照明光(或者叫激發光)A之后，會在很短的時間持續發出熒光B。掃描成像系統的分辨能力取決于A在樣品處的聚焦光點大小。Hell找到了熒光的開關——第三種光C，在C的照射下，熒光分子即使吸收了激發光A，也沒法再發出熒光B。Hell讓開關C同樣打在樣品上，形成一個四周亮、中心暗的“面包圈”，“面包圈”中心的暗區域比艾里斑還要小;然后把面包圈套在艾里斑上，就像在“管”的出口又加了一個小孔，使“管”的直徑大大減少，也就提高了整臺顯微鏡的分辨能力。

“面包圈”限制了激發光A的有效范圍

“我只看到星星”“我看到了銀河”——光激活定位顯微

熒光分子是熒光樣品的最小發光單元，由于衍射極限的限制，在相鄰的兩個熒光分子同時點亮時，我們只能看到一個光斑，但如果每次只點亮一個分子，就可以通過光斑，計算得到熒光分子的準確位置。

Eric Betzig和William E. Moerner采用的就是這樣一種方法，如果說STED技術核心是“擦除”，那么PALM技術的核心就是“定位”：Moerner發現存在光D可以“打開”熒光。通過控制D的照射劑量，保證每次只有少量熒光分子處在打開狀態;當熒光分子在開與關之間切換時，整幅圖像中的熒光信號就會像銀河中的星星一樣亮暗閃爍，只要進行足夠多次的開關和成像，就可以組合出整個樣品的圖像。

溶酶體膜在不同顯微鏡下的成像結果。(左)傳統光學顯微鏡成像;(中)光激活定位顯微鏡成像;(右)放大的光激活定位顯微鏡成像。

參考使用產品

美國普林斯頓公司-FERGIE

特點：

· 無像差光學設計,完全沒有彗形相差;

· FERGIE特有的光學設計可產生衍射極限圖像，適用于從紫外到近紅外波長的微光光譜應用;

· 集成TE冷卻背照式CCD，制冷低至-55°C，允許長的積分時間來檢測微弱的信號;

· 幀轉移CCD架構，1kHz的頻率捕獲光譜速率(合并10行);

· 基于FPGA的內部定時發生器;

· 動力學光譜模式，擁有微秒時間分辨率。

美國普林斯頓公司-IsoPlance

特點：

· 無雜散光設計;

· 出色的成像性能;

· 高光通量;

· 動力學塔輪，支持三個光柵，軟件控制自動旋轉;

· 高效率光學鍍膜，可選的銀，金或介電涂層的反射率為98%。

審核編輯 黃宇