微流控芯片技術詳解_微流控技術在生物醫學上的應用

　　微流控芯片技術（Microfluidics）是把生物、化學、醫學分析過程的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上， 自動完成分析全過程。由于它在生物、化學、醫學等領域的巨大潛力，已經發展成為一個生物、化學、醫學、流體、電子、材料、機械等學科交叉的嶄新研究領域。

　　本文首先介紹了微流控技術原理及微流控芯片的工作原理，其次詳細的闡述了微流控芯片技術，最后介紹了微流控技術在生物醫學上的應用，具體的跟隨小編一起來了解一下。

　　微流控技術原理

　　微流控（microfluidics ）是一種精確控制和操控微尺度流體，以在微納米尺度空間中對流體進行操控為主要特征的科學技術，具有將生物、化學等實驗室的基本功能諸如樣品制備、反應、分離和檢測等縮微到一個幾平方厘米芯片上的能力，其基本特征和最大優勢是多種單元技術在整體可控的微小平臺上靈活組合、規模集成。是一個涉及了工程學、物理學、化學、微加工和生物工程等領域的交叉學科。

　　微流控是系統的科學技術，它使用幾十到幾百微米尺度的管道，處理或操控很少量的（10*至10~18升，1立方毫米至1立方微米） 流體。最初的微流控技術被用于分析。微流控為分析提供了許多有用的功能： 使用非常少的樣本和試劑做出高精度和高敏感度的分離和檢測，費用低，分析時間短，分析設備的印記小。微流控既利用了它最明顯的特征一一尺寸小，也利用了不太明顯的微通道流體的特點，比如層流。它本質上提供了在空間和時間上集中控制分子的能力。

　　微流控芯片的工作原理

　　微流控芯片采用類似半導體的微機電加工技術在芯片上構建微流路系統，將實驗與分析過程轉載到由彼此聯系的路徑和液相小室組成的芯片結構上，加載生物樣品和反應液后，采用微機械泵。電水力泵和電滲流等方法驅動芯片中緩沖液的流動，形成微流路，于芯片上進行一種或連續多種的反應。激光誘導熒光、電化學和化學等多種檢測系統以及與質譜等分析手段結合的很多檢測手段已經被用在微流控芯片中，對樣品進行快速、準確和高通量分析。微流控芯片的最大特點是在一個芯片上可以形成多功能集成體系和數目眾多的復合體系的微全分析系統？微型反應器是芯片實驗室中常用的用于生物化學反應的結構，如毛細管電泳、聚合酶鏈反應、酶反應和DNA 雜交反應的微型反應器等。其中電壓驅動的毛細管電泳（Capillary Electrophoresis，CE） 比較容易在微流控芯片上實現，因而成為其中發展最快的技術。它是在芯片上蝕刻毛細管通道，在電滲流的作用下樣品液在通道中泳動，完成對樣品的檢測分析，如果在芯片上構建毛細管陣列，可在數分鐘內完成對數百種樣品的平行分析。

　　微流控芯片技術詳解

　　1、微流控芯片的基質材料

　　基質材料是微流控芯片的載體，在微流控芯片發展的初期，硅材料作為構建微流控芯片的首選材料而被廣泛使用，這主要歸因于業已成熟的半導體技術。但是隨著研究的不斷深入和應用領域的不斷拓展，它表現出了不同程度的局限性：硅材料屬于半導體，不能承受高電壓，此外，硅材料不透明，與光學檢測技術不兼容。

　　玻璃材料具有很好的電滲性質和優良的光學性質，無論是從其物理性質還是化學性質來講，都非常適合于微流控芯片的制作，但是它的光刻和蝕刻技術工藝復雜、費時，制作成本過高，這些因素制約了玻璃微流控芯片的應用和推廣。

　　因此，研究者們開始把更多的注意力轉向了原材料便宜、加工制作簡單的高分子聚合物，目前，以聚二甲基硅氧烷（PolydiMethyl-Siloxane，PDMS）為代表的有機高分子聚合物已成為微流控芯片研究的熱點，PDMS表現出了非常理想的材料特性：良好的絕緣性，能承受高電壓，已廣泛應用于各種毛細管電泳微芯片的制作；熱穩定性高，適合加工各種生化反應芯片；具有很高的生物兼容性和氣體通透性，可以用于細胞培養；同時具有優良的光學特性，可應用于多種光學檢測系統；彈性模量低，適合于制作微流體控制器件，如泵膜等。此外，PDMS還可以和硅、氮化硅、氧化硅、玻璃等許多材料形成很好的密封。此外，較常用的高分子聚合物還包括聚甲基丙烯酸甲酯（PolyMethylMethAcrylate，PMMA）、聚碳酸酯（PolyCarbonate，PC）等。

　　2、微流控芯片的加工技術

　　微細加工技術是微流控芯片發展的前提條件，微流控芯片的制作技術首先起源于制造半導體及集成電路芯片所廣泛采用的光刻（Lithography）和蝕刻技術（Etching），目前已經廣泛地用于硅片、玻璃和石英等基質材料上微流體網絡的制作。其微制造工藝為：首先通過光學制板照相技術制備包括微流控芯片圖案的掩模，制備好的掩模通常是鍍有鉻層的石英玻璃板；然后用甩膠機均勻地在芯片表面涂敷一層光刻膠，在紫外光下進行曝光，顯影。上述工作完成之后，用相應的腐蝕劑對芯片進行蝕刻，蝕刻完成后，去除剩余的光刻膠便可獲得所需的芯片微細結構。該方法工藝周期長、制作成本高，但其微加工技術非常成熟。

　　與硅片、玻璃材料不同的是，可用于微流控芯片加工制作的高分子聚合物種類繁多，而且各材料之間的物理化學性質差別很大，所以它們的微加工技術表現出了一定的多樣性，目前主要有模塑法、熱壓法、LIGA技術、激光燒蝕技術和軟光刻法等。

　　a、模塑法（Injection Molding）

　　是指通過光刻掩模技術制得凸起的微流控芯片陽模，然后在陽模上澆注液態的高分子聚合物，當高分子聚合物完全固化后將其與陽模剝離即可得到具有微流體網絡的基片，適宜采用模塑法的高分子材料應該具有很低的黏度和很低的固化溫度，如PDMS，環氧樹脂，聚四氟乙烯等材料。

　　b、熱壓法

　　也是一種需要陽模的微流控芯片制造技術，該技術主要利用了高分子聚合物的玻璃轉化溫度。與模塑法相比，熱壓法制得的微通道重復性較差，而且管道易產生變形，操作條件相對苛刻。該方法主要應用于熱塑性材料的加工，如PMMA和PC等。

　　c、激光燒蝕（Laser Ablation）

　　是一種新型的微細加工技術，它是通過紫外激光降解高分子聚合物，適宜激光燒蝕加工的材料有PMMA、聚苯乙烯、硝化纖維等。

　　3、微流控芯片的微流體控制技術

　　微流體操縱技術是微流控芯片技術中最重要的一個研究領域之一，通過各種機械或非機械力實現對流體的驅動和控制。依據微流體驅動體系中有無機械活動部件，可以將其分為機械和非機械驅動系統。

　　a、機械驅動系統

　　主要包括壓電微泵、靜電微泵等，它主要是通過靜電、壓電等不同方法來觸發引起的機械部件的運動，從而為微流體提供動力源，這種泵的優點是任何流體都可以推動，但其所驅動的流體呈脈沖狀而不是連續式的。

　　b、非機械驅動系統

　　主要包括電滲泵、熱毛細管泵等，其中電滲泵是微流控芯片系統中最常用的一種驅動力，相對于微機械壓力驅動的泵來說，電滲泵有很多優點：如電滲泵易于制作而且沒有任何移動部件，電滲泵的樣品柱只有少量的擴散，此外，可以采用改變微通道壁x（電勢）的方法來進一步控制電滲流的量和方向。

　　4、微流控芯片檢測技術

　　微流控芯片的結構特征決定了其檢測技術的特殊性，與傳統檢測儀器相比，微流控芯片對其檢測系統提出了更高的要求，如要求靈敏度高、響應速度快、具有平行分析功能和便攜式特征等，目前基于不同原理的很多檢測技術都已經應用到微流控芯片的研究中，主要有光學檢測、電化學檢測、質譜等方法。

　　a、光學檢測

　　光學檢測是微流控芯片檢測方法中應用最廣的一種，其優點在于靈敏度高、實用性強，且檢測器與分析對象不需直接接觸。其中激光誘導熒光檢測（Laser Induced Fluorescence，LIF）是目前最靈敏的檢測方法之一，其靈敏度達到10-9mol/L~10-12mol/L，對于某些熒光效率高的分子，其檢測能力可以達到單分子水平，因此它也是當前商品化微流控系統中唯一被采用的檢測器。但該檢測設備價格昂貴，而且體積龐大，與微尺寸的微流控芯片極不匹配，一定程度上限制了其廣泛推廣與應用。

　　b、電化學檢測

　　基于電化學檢測原理的檢測系統可以說是最完整的、最集成、最理想的芯片檢測系統之一，這主要有兩方面的原因：一方面，微電極的制造技術與當前微流控芯片的加工工藝是完全兼容的，可以實現大批量生產；另一方面，電化學檢測具有靈敏度高、選擇性好、不受光程和樣品渾濁度影響等優點，且只需要極少的外圍輔助設備即可實現快速檢測，圖1給出的是一種便攜式電化學檢測系統。無疑，基于電化學原理的芯片檢測技術代表未來芯片檢測器的一個重要發展方向，顯示了巨大的應用價值和潛力。

　　c、質譜檢測

　　質譜檢測技術作為生物化學分析的重要手段，由于能夠提供試樣組分中生物大分子的基本結構和定量信息，所以在微流控芯片檢測器中表現出了巨大潛力，但當前質譜檢測的瓶頸在于質譜儀與微流控芯片的接口問題。

　　微流控技術在生物醫學上的應用

　　從微流控芯片的分析性能看，其未來的應用領域將十分廣泛，并且其應用領域仍在不斷地拓展之中，但目前的重點顯然是在生物醫學領域。除此之外，高通量藥物合成與篩選、環境監測、食品衛生、刑事科學及國防等方面也會成為重要的應用領域?，F僅就微流控芯片在生物醫學領域的應用舉三個例子說明微流控芯片系統的巨大潛力：

　　1、毛細管電泳分離

　　毛細管電泳芯片是微流控芯片中發展最早、也是發展最快的一項芯片技術，目前已經成為微流控芯片領域中最令人矚目的一個分支。與傳統的毛細管電泳相比，它具有自動化程度高、樣品消耗少、分析速度快以及高通量等特征，在對DNA片段、多肽、蛋白質等生物大分子的分析中，它表現出了超強的分離分析能力，它被認為是后基因時代中最有希望攻克蛋白質研究、基因臨床診斷等科學難題的分離分析手段之一。

　　1992年Manz A發表了第一篇有關毛細管電泳芯片的論文，該文以熒光染料為分析對象，以電滲流作為流體驅動力，在芯片微流體網絡中成功地實現了流體控制，向人們展示了毛細管電泳芯片的雛形和其優越的分離分析能力，這一研究成果引起了學術界的廣泛關注和興趣，相繼各種用于氨基酸、蛋白質、藥物等分離的芯片也不斷開發成功。為了進一步提高芯片的分析能力，Mathies領導的研究小組最近在直徑為200mm的圓盤玻璃芯片上集成384個毛細管電泳微通道，其有效分離長度達到了8cm，對100bp（base pair，堿基對）~1000bp的基因標準標記物達到了優于10bp的分辨率，并在該芯片上完成了1163D變異基因的PCR-RFLP（限制性片斷長度多態性）分析，為臨床診斷提供了依據。

　　毛細管電泳微芯片是微流控分析芯片中產業化程度最高、也是最先實現商品化的一類芯片，早在1999年，美國惠普（現為安捷倫）與Caliper Tech-nologies公司聯合研制的第一臺微流控芯片商品“2100生化分析儀”就已經開始投放市場，該系統使用CAliper公司生產的玻璃芯片，采用LIF進行檢測，并配了5~6種試劑盒配合使用，可對DNA、RNA片段及蛋白質等進行電泳分離檢測，玻璃芯片尺寸為1.8cm×1.8cm，有效分離長度約1.6cm，30min可同時完成12個樣的分離檢測。與傳統的基因和蛋白質電泳相比，芯片毛細管電泳無需樣品的走膠、染色、脫色工序，無需干燥和照相等煩瑣耗時的步驟，同時快速測試多個試樣，獲得基因和蛋白質的電泳圖和曲線。整個測試過程簡化為快速、簡易的三個步驟：裝載樣品、進行分析、觀察數據。

　　2、基因測序

　　毛細管電泳的一個重要應用領域是基因測序，正是因為96根毛細管電泳陣列儀廣泛地應用于人類基因組計劃的測序工作之中，才使舉世矚目的人類基因組計劃的進程大大加快，使之由原定的2003年提前到2000年基本完成。事實上，從基因測序的原理來講，芯片毛細管電泳測序和普通毛細管電泳測序是完全一致的，但前者表現出了更大的優越性：首先由于芯片毛細管電泳獨特的注樣方式和更細的分離通道，所以它能實現DNA的快速分離；另一方面微流控芯片采用了半導體工業中成熟的微加工技術進行制造，所以一塊芯片上可以集成更多的毛細管，實現高通量測序；最后由于它實現了產物處理和分析的集成化，減少了人為干擾，因此更進一步地降低了操作成本。

　　Mathies領導的研究小組早在1995年就開始在微流控芯片上開展了DNA測序工作，他們在一塊有效分離長度為3.5cm的芯片上測序了150個堿基，他們利用芯片變性毛細管電泳在10min之內就完成了對433個堿基序列的測定。該測序芯片的毛細管長度為3.5cm，橫切面尺寸50μm×8μm。為了進一步提高DNA測序能力，到2001年他們在直徑為150mm的圓形玻璃芯片上，刻蝕出了96個呈輻射型排布的毛細管電泳通道陣列，由于芯片采用旋轉掃描LIF法進行檢測，所以可實現平行測序，測序達500堿基。

　　3、PCR反應

　　生化反應芯片的功能就是把在普通實驗室中進行的生化反應實驗縮微到一塊小小的芯片上來完成。目前報道的生化反應芯片主要包括聚合酶鏈反應（Polymerize Chain Reaction，PCR）芯片、藥物合成芯片等，其中PCR芯片是生化反應芯片的典型代表。眾所周知，常規PCR需要制樣、擴增及檢測等步驟，既費時又費力，而當用微流控芯片進行PCR擴增及相關檢測時，則可大大簡化操作步驟、顯著提高檢測效率。1993年Northrup等人以硅片和玻璃為基質材料首次報道了一種PCR芯片，并通過實驗證明了PCR芯片可行性。該芯片的反應室刻蝕在硅片中，體積約為幾微升，加熱器也直接集成在芯片上，與傳統的PCR相比，在相同擴增效率下，該芯片的熱循環效率快2~ 10倍。為了進一步提高PCR芯片的熱循環速度，Kopp M U等人發展了一種連續流動式的PCR芯片，流動式芯片下面有95℃、72℃、60℃三個不同的恒溫區間，當樣品流經它們時就會實現自動變溫，在流動中完成變性、退火和延伸反應，達到PCR擴增的目的。

　　另外，一旦把PCR芯片與毛細管電泳芯片二者集成起來的時候，其優勢就顯得更為明顯。Lagally E T等人在玻璃芯片上制作了集閥門、疏水孔、PCR反應池以及毛細管電泳（Capillary Elec-trophoresis，CE）于一體的芯片系統，PCR反應池體積是280nL，PCR擴增前所需模板濃度為20拷貝/mL，反應室中平均僅為5~6個DNA模板分子，加熱器和熱電偶集成在芯片的背面，10min即可完成20個循環。反應完成后，PCR反應產物在電滲泵的驅動下進入毛細管電泳芯片中，進行在線CE分離分析。該芯片系統集取樣、PCR擴增和CE分離于一體，節省了試劑消耗、加快了分析速度，同時也避免了實驗操作中的人為污染。