開發一種計算機視覺方法來自動識別芯片上的陽性和陰性樣本

微流體的運輸、分配和混合通常需要借助額外的器件，如泵和閥門，不利于其在即時診斷（POC）裝置中的應用。因此，美國加州大學Du Ke教授及其團隊提出了一種簡單的微流控病原體檢測系統，稱為旋轉芯片，通過手動旋轉兩個同心層在微孔之間轉移試劑，而不使用外部儀器。該旋轉芯片是由一個簡單的計算機數控（CNC）加工工藝制造的，并能夠通過一個簡單的30度或60度旋轉進行60次多路反應。利用超疏水涂層，在沒有明顯泄漏的情況下，流體輸送效率可以達到92.78%。與細胞內熒光檢測相結合，對耐淀粉類大腸桿菌（E. coli）的芯片上檢測限為1.8×10?CFU/mL，這與該研究的芯片外檢測結果相似。此外，該研究還開發了一種計算機視覺方法來自動識別芯片上的陽性和陰性樣本，顯示了100%的準確性。

該旋轉芯片具有簡單、低成本和高通量的優勢，并可以用單個芯片圖像顯示測試結果，是在資源有限的環境下進行各種多路復用POC應用的理想選擇。相關研究內容以“Superhydrophobic Rotation-Chip for Computer-Vision Identification of Drug-Resistant Bacteria”為題發表在ACS AMI期刊上。

圖1a顯示了大腸桿菌檢測試驗的結果，在透照器的紫外光下，在旋轉芯片中可以觀察到定性檢測結果。圖1b顯示了旋轉芯片作為一對數控加工的具有不同特征的聚碳酸酯圓盤的組裝。圖1c及其附屬橫截面圖顯示了在試驗中運行測試組的操作機制，其中藍色和紅色液體分別代表試劑和樣品。在圖1d中，兩步芯片執行相同的流體動力學，但加入二次試劑產生兩種試劑的混合物，在60度旋轉結束時混合樣品，分別用紅色、紫色和黃色表示。

圖1 旋轉芯片的設計和操作

圖2a分別為無涂層的旋轉芯片、特氟隆涂層和neverwet涂層的接觸角（從左到右），其中，NeverWet涂層處理的疏水性最強，其靜態接觸角為156.8°。旋轉芯片在NeverWet涂層前后的掃描電鏡圖像如圖2b所示，NeverWet涂層由氟碳涂層的二氧化硅顆粒組成，以產生表面粗糙度和天然的超疏水性。NeverWet涂層旋轉芯片在不同條件下的泄漏計數如圖2c所示。圖2d顯示了未涂層、聚四氟乙烯涂層和NeverWet涂層旋轉芯片的傳輸效率結果，NeverWet涂層芯片運輸92.78%，而特氟隆涂層的試劑僅為86.02%。圖2e是在NeverWet涂層前后的兩步芯片上的食品染料演示，在NeverWet涂層（上排）之前，在試劑加載和芯片旋轉過程中都有液體泄漏，經過NeverWet涂層（下排）后，液體泄漏顯著最小化，避免了樣品污染，提高了試劑利用率，提供了更準確的結果讀數。

圖2 旋轉芯片的表面處理及傳輸效率

圖3a顯示了β-gal對非熒光FDG的兩步連續水解，首先將其轉化為單-半乳糖苷酶（FMG），然后轉化為高熒光熒光素（激發/發射，488/512），可以通過LED透照器檢測到。對純化的不同活性（0 - 1 U）的β-gal進行反應的芯片外檢測結果的熒光強度（512 nm）如圖3b所示。隨著β-gal濃度的增加，FDG水解產生更多的熒光素，熒光強度增加（圖3c）。在上片實驗中，在試劑陣列中加入100μL FDG，每孔中依次加入5μLβ-gal。經過旋轉和孵育后，用LED照明器從底部激發芯片，結果如圖3d所示。

圖3 β-半乳糖苷酶（β-gal）對熒光素二?-D-半乳糖糖苷（FDG）的影響

如圖4a所示，當大腸桿菌濃度高于1.8×10?CFU/mL時，用肉眼可以很容易地觀察到陽性組和陰性組之間的熒光差異。然后用熒光光譜儀定量各組的熒光強度，在FDG濃度為0.25 nM時的結果如圖4b所示。當FDG濃度為0.25 nM時，四組間的積分熒光信號最高，log-log線性擬合最佳（Pearson‘s r = 0.9734）（圖4c），因此選擇了0.25 nM的FDG進行上片實驗。孵育前的FDG和大腸桿菌負載芯片，大腸桿菌濃度在1.8×10?~9×10?CFU/mL之間（圖4d（上））。當大腸桿菌濃度高于1.8 ×10?CFU/mL時，很容易觀察到熒光信號，與芯片外的結果相當（圖4d（底部））。

圖4 通過改變FDG濃度優化大腸桿菌

圖像處理和測試樣本分類的整個管道如圖5所示。將檢測到的陽性樣本與陰性樣本分離，最終獲得了100%的分類準確率。

圖5 計算機視覺的圖像處理和測試結果

綜上所述，旋轉芯片與其他POC系統相比，由于其設計、操作和可制造性，在病原體檢測方面有許多優勢。首先，旋轉芯片的設計具有良好的便攜性、高通量和可靠性。通過采用旋轉設計，旋轉芯片可以提供相同的流體操作，同時保持所有敏感特性在一個覆蓋狀態，并保持機械完整。這種設計降低了芯片的空間足跡，并增加了其最大特征密度，以提高可移植性和通量。疏水性表面處理是一種有效的防泄漏解決方案，而不影響機械完整性或需要專用密封，可以通過使用市面上廉價且易于應用的的噴涂涂層來實現超疏水表面。其次，旋轉芯片的簡單設計只需要一個簡單的手動操作，以及一個簡單的四步過程：加載、旋轉、孵育和讀取。用戶可以遵循上述流程，在無需使用復雜實驗室設備或解釋熒光曲線的情況下獲得定性結果。這降低了過程的復雜性，并進一步降低了成本，無需使用水浴及其附件供應，如可密封袋，以防止水在孵化期間進入芯片。在未來，智能手機應用程序可以開發使用本研究中強大的計算機視覺的方法，并直接與旋轉芯片結合，以精確、自動和高通量的檢測應用程序。

審核編輯：劉清