拉曼光譜儀的光學微型化方案研究

拉曼光譜學（Raman spectroscopy）提供了一種微尺度下對化學成分的無損、無標記定量研究手段?，F有的拉曼光譜儀微型化策略主要存在以下問題：光譜分辨率及光譜范圍不足、高水平傳感器暗噪聲導致的信噪比（SNR）受限、傳感器像素間的量子效率（QE）變化較大、共焦性或深度分層差、激光波長和激光器光功率不穩定、激光光學反饋靈敏度高以及功耗高。

據麥姆斯咨詢報道，近日，丹麥技術大學（Technical University of Denmark）的科研團隊提出了一種厘米級微型拉曼光譜儀，采用了經濟型非穩定激光二極管、密集光學元件和非制冷小型傳感器。其性能可與昂貴、體積龐大的科研級拉曼系統相媲美。該微型拉曼光譜儀具有出色的靈敏度、低功耗、完美的波數以及強度校準，并在400 ~ 4000 cm?1范圍內利用內置參考基準實現了7 cm?1的分辨率。該微型拉曼光譜儀的高性能和通用性在應用實例中得到了證明，應用實例包括飲品中甲醇的定量測定、人體皮膚的活體拉曼測量、發酵監測、亞微米分辨率的化學拉曼映射、抗癌藥物甲氨蝶呤（MTX）的定量表面增強拉曼光譜（SERS）映射以及體外細菌鑒定等?？梢灶A見，這種微型化策略有望使超緊湊型拉曼光譜儀集成到智能手機和醫療設備中，從而推動拉曼技術的普及。相關研究成果以“Optics miniaturization strategy for demanding Raman spectroscopy applications”為主題發表在Nature Communications期刊上。該論文的第一作者和通訊作者均為Oleksii Ilchenko。

拉曼光譜儀的微型化

拉曼系統的微型化主要包括：（1）光譜儀的微型化；（2）拉曼光束傳輸路徑的微型化；（3）激光光束傳輸路徑的微型化；（4）分束裝置的微型化；（5）采樣光學元件的微型化。因此，除光譜儀本身外，微型化還會影響激光器的選擇。這項研究從激光器相關問題開始闡述其微型拉曼光譜儀。

該研究所研制的微型拉曼光譜儀的光學方案如圖1a所示。近紅外（NIR）增強成像CMOS傳感器在800 ~ 960 nm波段同時采集了“指紋”范圍（400 ~ 2700 cm?1）的兩個拉曼光譜（即主通道和參考通道），如圖1c所示。

圖1 微型化拉曼系統的光學布局及工作原理

拉曼光譜儀的靈敏度很大程度上取決于探測器的暗噪聲。為了在不顯著降低靈敏度的前提下實現微型化，研究人員采用了具有4 μm小像素尺寸的CMOS傳感器，并使用高數值孔徑（NA）成像鏡頭（圖1a中的L6）將拉曼光譜信號壓縮到傳感器上的單行中（如圖2a）。信號壓縮帶來的好處主要有：（1）最大限度提高每個像素的信噪比；（2）避免對具有非必要額外暗噪聲的額外行進行平均。實驗顯示，SERS信號總強度等量分布在CMOS傳感器的20行中（如圖2b）。該微型拉曼光譜儀采用非波長穩定激光器，這使其能夠補償另一個靈敏度限制因素，即光譜傳感器像素間的QE變化（如圖2e）。

圖2 微型化拉曼系統的靈敏度和量化性能論證

這項研究采用了一種離軸激光光束傳輸方法，該方法避免了激光反向反射進入激光孔徑，同時提高了微型化能力（如圖2h）。除了激光光學隔離外，離軸激光光束傳輸還支持空間偏移拉曼光譜（SORS）條件，使其避免樣品內部離焦層產生不必要的熒光。

微型拉曼光譜儀的應用實例

隨后，研究人員分別在五個應用實例中證明了該微型拉曼光譜儀的高性能和通用性。

應用實例一：伏特加中有毒甲醇的定量測定。為了證明該微型拉曼光譜儀的靈敏度和定量性能，研究人員對含有不同濃度甲醇的伏特加樣品進行了測量。甲醇定量的偏最小二乘法（PLS）校準結果如圖2l至圖2p所示，檢測限（LoD）為0.07%，定量限（LoQ）為0.25%。

應用實例二：發酵過程中營養物質和代謝物的定量測定。研究人員使用微型拉曼光譜儀對大腸桿菌培養過程中產生的pHCA進行離線定量測定，直接測量了細菌上清液樣品的拉曼信號（如圖3g）。結果表明，該微型拉曼光譜儀具有較高的靈敏度，pHCA的檢測限約為0.01 g/L，葡萄糖的檢測限約為1 g/L。

圖3 用于發酵監測和活體皮膚測量的微型拉曼光譜儀

應用實例三：活體皮膚測量?；铙w皮膚測量通常需要復雜的拉曼儀器，這是由于皮膚的拉曼橫截面較小，特別是在深度超過100 μm時，需要深度制冷傳感器。圖3j和圖3k展示了緊湊型皮膚探針。該探針可以優化不同深度的皮膚測量（0 ~ 150 μm）。當微型拉曼光譜儀配備這種探針時，能夠采集10 ~ 20 μm深度的皮膚拉曼光譜，信噪比優于500:1（1 s曝光時間，重復5次）。圖3n至3s顯示了兩種激光（785 nm和675nm）在不同皮膚區域（手指、手和臉頰）獲得的拉曼光譜。

該微型拉曼光譜儀的光學設計采用了交叉狹縫共焦概念（如圖4a和圖4b），可進行共焦測量。該微型化拉曼顯微鏡是目前所報道的最小的共焦拉曼系統，其設計并未犧牲拉曼系統的基本性能。下面介紹了兩種具有挑戰性的拉曼顯微鏡應用，這些應用通常需要使用配備深度制冷傳感器的科研級系統。

圖4 用于生物醫學拉曼顯微鏡應用的微型化拉曼系統

應用實例四：通過SERS映射定量抗癌藥物。研究結果表明，采用配備深度制冷EMCCD的科研級拉曼顯微鏡進行SERS映射的納米柱輔助分離（NPAS）方法，可以在5 ~ 150 μM的線性范圍內測量PBS中的MTX，檢測限為5 μM，定量限為25 μM。研究人員還使用NPAS方法對SERS芯片表面進行SERS映射（如圖4g）。

應用實例五：體外細菌鑒定。在這方面，僅需一個步驟，拉曼光譜有望實現快速、無標記、無培養的鑒定和抗菌藥敏試驗（AST）。本實驗中，研究人員使用該微型化拉曼顯微鏡來測量與之前發表報道中完全相同的細菌分離物，當時研究使用了配備深度制冷CCD的科研級拉曼顯微鏡（如圖4n），同時采用了完全相同的樣品制備過程和數據分析，測得的不同細菌的拉曼光譜如圖4m所示。

綜上所述，這項研究的基本策略是圍繞拉曼頻移和激光強度的內置實時校準，并通過多種數據處理算法輔助來實現拉曼光譜儀的微型化。此外，該微型化策略還包括：降低傳感器暗噪聲、補償像素間的QE變化、激光光學隔離以及保持高光譜分辨率。此外，該研究的微型化策略還提供了寶貴的移頻激發差分拉曼光譜（SERDS）和空間偏移拉曼光譜（SORS）功能。與典型的手持式拉曼設備相比，該光譜儀在光譜分辨率、信噪比、操作準備時間、波數和強度校準精度等大多數重要參數上均有改進。此外，該微型光譜儀的整體性能可與高端臺式拉曼光譜儀和顯微鏡相媲美。該研究方法提供的高性能和廣泛適用性便于其簡單集成到各類儀器和多種應用中。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-47044-7

審核編輯：劉清