用于促進生物膜清除和糖尿病傷口愈合的多酶級聯雙層微針反應系統

生物膜的存在仍然是慢性傷口愈合的重要障礙，包括糖尿病傷口。生物膜的胞外聚合物（EPS）屏障致密，導致藥物滲透性差，使生物膜的清除成為一項具有挑戰性的任務。此外，高葡萄糖水平會阻礙傷口愈合的過程。

近日，西北大學范代娣教授團隊首次將酶生物膜破壞與基于氧化石墨烯的化學動力學治療（CDT）相結合，開發了一種多酶級聯微針（MN）系統。微針尖快速溶解，并將α-淀粉酶和葡萄糖氧化酶負載的金屬有機框架MIL-101 （M@G）輸送到生物膜內部。α-淀粉酶分解EPS結構，使細菌變得脆弱，并產生葡萄糖作為下一個級聯反應的底物。

接下來，Gox利用EPS降解產生的葡萄糖，在傷口部位產生大量的H?O?，然后通過MIL-101轉化為活性氧（ROS）。該系統通過順序破壞EPS，在傷口處消耗葡萄糖，并自供H?O?產生ROS來清除耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）生物膜，從而降低葡萄糖濃度，同時減少細菌感染和炎癥反應。

此外，促血管生成肽功能化水凝膠（Gel-Q-M）作為支持促進膠原沉積和血管生成，從而加速慢性傷口愈合。因此，構建的微針平臺在體外具有良好的抗生物膜和血管生成性能，可以有效清除生物膜，減少炎癥，促進糖尿病傷口愈合。相關論文以“Amulti-enzyme cascade microneedle reaction system for hierarchically MRSAbiofilm elimination and diabetic wound healing”為題發表在ChemicalEngineering Journal期刊上。

考慮到糖尿病傷口中的血管阻塞和肉芽組織再生，該研究使用接枝有促血管生成肽QHREDGS的明膠水凝膠作為微針的背襯層。在傷口愈合階段釋放多肽可促進血管新生以及膠原沉積?？傊?，雙層微針設計考慮了傷口愈合的不同階段，通過分級破壞EPS，降低傷口處的葡萄糖濃度，自我供應H?O?以產生ROS，并釋放肽以促進血管生成，提供了解決生物膜感染和慢性傷口愈合的有前景的戰略平臺（圖1）。

圖1 多酶級聯雙層微針貼片清除MRSA生物膜，并促進糖尿病傷口愈合的示意圖

隨后，研究人員利用TEM、SEM、Zeta和XPS等多種方法對MIL-101和M@G表征進行了系統性地分析。

圖2 材料的表征

此外，研究人員對合成的MIL-101的芬頓活性進行了驗證。用TMB比色法檢測不同條件下羥基自由基的產生。無色的TMB可被羥基自由基氧化成藍色，在652 nm處顯示出清晰的吸收峰。如圖3D，在不存在H?O?的情況下，羥基自由基的產生幾乎檢測不到。加入H?O?后，在酸性溶液中羥基自由基的產生量遠高于中性溶液，表明合成的MIL-101具有優異的芬頓活性，酸性條件能顯著增強活性氧的產生。在負載Gox之后，評估在葡萄糖存在下M@G的級聯催化效應。如圖在相同濃度的M@G下，隨著葡萄糖濃度的增加，·OH在652 nm處的吸收峰顯著增大。

接下來，研究人員使用實時pH計、TMB法和ESR測量驗證了級聯反應過程中pH的變化和H?O?和·OH的形成。如圖3F，溶液的pH在12小時內從5.8繼續降低至4.2。此外，隨著反應的進行，中間體H?O?的產生逐漸增加（圖3G）。同時，M@G的濃度越高，葡萄糖消耗越多（圖3H），產生的H?O?越多。結果表明，葡萄糖可以連續氧化生成葡萄糖酸和H?O?，pH的降低和過氧化氫的產生也為MIL-101催化芬頓反應提供了適宜的酸性環境和底物。其次，以5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）為捕集劑，用ESR方法驗證了反應體系中·OH的生成。如圖3I所示，·OH的典型的1：2：2：1特征峰譜，峰強度隨葡萄糖濃度的增加而擴大，表明級聯反應成功地產生了羥基自由基。上述結果表明，所構建的M@G納米粒子可以通過自身供給的H?O?和葡萄糖誘導的級聯催化反應產生羥基自由基。

圖3 MIL-101與M@G的催化活性表征

整個雙層微針貼片（WMN）由10 × 10的針尖陣列組成，并且背襯是直徑為1 cm的圓形。SEM圖像顯示尖端是均勻的和金字塔形的（高度約700 μm，基部直徑約300 μm，針間距約300 μm）。為了驗證該微針貼片的機械性能，將含有羅丹明B染料的微針應用于離體新鮮大鼠皮膚。插入后3分鐘移除背襯部分顯示出清晰的紅點陣列（圖4F）和相應的皮膚H&E染色。圖4G還顯示出了針尖的形狀，證明針尖成功地插入皮膚中。壓縮試驗進一步用于測量微針的機械強度，在200 μm位移下，納米顆粒加載微針的機械強度略高于未加載微針，這與文獻報道的一致。機械力為0.39 N/針，其足以穿透皮膚和生物膜（圖4H）。使用瓊脂糖模擬皮膚研究微針貼片的溶解。如圖4I，微針尖端在三分鐘內逐漸溶解以快速釋放抗菌劑和抗生物膜劑。

從3 min~ 5 min，Fe3?的累積釋放逐漸達到一個平臺，表明大部分負載M@G已被釋放，且少量增加可能是由于M@G位于尖端與背部界面連接處。為了觀察藥物的分布，以FITC標記的Gel-Q-M為背襯，羅丹明B為模型藥物在針尖處，圖中的熒光圖像。4J顯示紅色熒光富集在尖端部位，而背襯顯示綠色熒光，表明兩種染料的均勻分布。此外，值得注意的是，背襯層的UV照射時間的選擇直接影響水凝膠的交聯程度，并因此影響肽的釋放。因此，肽從FITC標記的Gel-Q-M微針貼片的釋放通過測量在不同UV照射時間下的熒光強度來表征。增加的交聯時間延長了肽釋放時間（圖4K）。

圖4 微針的制備與表征 鑒于M@G的優異級聯催化作用和產生羥基自由基的能力，研究人員接下來驗證了微針貼片的體外抗菌能力。圖5和圖6展示出了強大的抗菌能力和細菌生物膜清除能力。此外，細胞實驗（圖7）表明M@G也被證明具有優異的生物相容性和促進血管生成能力。

圖5 體外抗菌性能

圖6 微針體外生物膜清除能力

圖7 微針體外生物相容性及促血管生成能力的評價

接下來，研究人員通過在I型糖尿病大鼠的皮膚上構建MRSA生物膜模型來評估微針貼片的體內抗生物膜和傷口愈合能力（圖8）。在治療后第9天，雙層微針組的傷口面積顯著小于其他三組，并且傷口在第12天基本上完全閉合，這證明雙層微針貼片在促進生物膜感染糖尿病傷口的傷口愈合中是有效的，這歸因于尖端的抗生物膜的協同作用和背襯層的血管生成作用。此外，多酶級聯降低了傷口部位的葡萄糖濃度，這也可能有助于加速傷口愈合。

圖8 微針體外生物相容性及促血管生成能力的評價

綜上所述，該研究將酶促生物膜破壞與Gox偶聯CDT結合構建了微針系統，用于清除MRSA生物膜，促進糖尿病傷口血管生成，加速傷口愈合。微針的尖端穿透生物膜，將負載轉移到內部。釋放的α-淀粉酶為后續酶促反應提供葡萄糖底物，同時降解EPS。

隨后，存在于傷口中的α-淀粉酶生成的葡萄糖被M@G的Gox氧化生成大量的H?O?，在M@G的芬頓作用下產生高毒性OH，清除生物膜。該系統可以產生自供的H?O?，而不需要添加外源H?O?。這不僅破壞了生物膜結構，而且為級聯反應提供了底物，在產生H?O?的同時降低了傷口中糖尿病的濃度，一舉兩得。此外，從背襯層逐漸釋放的促血管生成肽平衡了傷口愈合的組織重塑階段。通過將多種功能集成到微針貼片中，可以顯著改善生物膜感染糖尿病傷口的治療。

審核編輯：劉清