微重力下3D組織結構的生物制造及其在人體病理生理研究中的應用

近年來，人們對生物工程的興趣日益濃厚，尤其是體內類3D功能組織，這促進了生物制造過程新方法的建立，并擴大了這些獨特的組織結構的應用。太空飛行過程中產生的微重力是一種獨特的環境，可能有利于組織工程過程，但不能在地球上完全復制。此外，在太空中進行人類和動物研究的費用和實際挑戰使生物工程微生理系統成為一種有吸引力的研究模式。

基于此，近期，約翰·霍普金斯大學的Deok-Ho Kim教授和美國布朗大學的Peter H.U. Lee教授對相關研究，例如利用真實和模擬的微重力來改善各種組織類型的生物制造，以及使用微生理系統（如器官/組織芯片和多細胞類器官）在空間中建立人類疾病模型等進行了總結，并討論了真實和模擬的微重力平臺及其在組織工程微生理系統中的應用，包括：（1）應用微重力條件改進組織結構的生物制造；（2）利用在微重力條件下制作的組織結構作為地球上人類疾病的模型；（3）利用生物制造的體外模型研究微重力對人體組織的影響。相關內容以“Biomanufacturing of 3D tissue constructs in microgravity and their applications in human pathophysiological studies”為題發表在Advanced Healthcare Materials期刊上。

真實微重力（r-μG）可以通過在飛機或太空飛行器上的自由落體飛行模式來實現。根據飛行的高度，這些平臺可以分為拋物線、亞軌道和軌道（圖1）。飛機上的拋物飛行通常在大約10公里的高度進行（圖1A）。在拋物線飛行期間，一架飛機在大約20 ~ 40秒的自由落體r-μG階段和1.8 G的超重力上拉階段之間交替飛行20 ~ 60條拋物線（圖1B）。與拋物線飛行不同，亞軌道飛行（圖1C）有一個更長的軌道，可以達到海平面以上100公里，達到空間的技術邊界。國際空間站（ISS，圖1D、E）于1998年發射后，作為μG研究環境實驗室，是目前使用最密集的r-μG研究平臺。

圖1 用于生物研究的真實微重力平臺

旋轉壁容器（RWV），或旋轉細胞培養系統（RCCS）由一個可以裝滿培養基的圓柱體組成，并以恒定的速度圍繞其中心軸不斷旋轉，以及一個氧氣補充單元，或者在培養柱的中心作為一個較小的靜態鋼瓶，或者在其底部作為一個多孔板（圖2A）。

RWV通過向上的水動力牽引，迫使圓柱體中的粒子進行連續的圓周運動，從而創造了μG條件，這反過來在理論上與旋轉過程中產生的向下重力相抵消（圖2B）。恒定器是一種裝置，它使樣品圍繞單個或多個軸連續旋轉，以抵消向下的重力對生物系統的影響（圖2C）。

在旋轉過程中，樣品向下的重力可以在數學上平均為零，在旋轉軸周圍產生一個類似μG的理論環境（圖2D）。與2D傾斜器使樣品保持在圓柱形表面上旋轉不同，3D傾斜器使樣品在虛擬球形平面上旋轉（圖2E）。為了獲得更好的μG模擬結果，研究人員通過隨機化兩個軸的轉速和方向，進一步優化了3D傾斜器（圖2F）。

圖2 工程組織模擬微重力的方法

生物制造的目標是生成與生理相關的功能性3D組織結構，如微組織（即球狀體）和具有典型的細胞和大分子組織的類器官。3D細胞結構允許相同或不同類型的細胞之間的多維附著和相互作用，與2D細胞培養相比，這更好地模擬了體內環境。因此，3D組織結構被更多地用于臨床應用，包括體外疾病建模和植入。在模擬微重力（s-μG）環境中，細胞可以懸浮在培養基中，形成具有改進的生理特性的多細胞球狀體，包括更大的尺寸、更小的缺氧中心、微結構，以及有或沒有微載體作為支架的組織特異性標記物的表達（圖3）。例如，RWV（圖3A左）制作的人骨類器官比標準重力（圖3A右）表現出更高的堿性磷酸酶（ALP）的表達。

在RWV中形成的人胚胎干細胞來源的神經類器官顯示了神經標記物MAP2的表達（圖3B）。在RWV中形成的人肝類器官具有多層結構（圖3C）。在r-μG條件下形成的人誘導多能干細胞（hiPSC）來源的心臟類器官比在標準重力條件下形成的球狀體顯示出更大的直徑（圖3D）。在RWV中培養的類器官中可以觀察到滋養層細胞的融合（圖3E）。在RWV中形成的人腸上皮類器官顯示了上皮特異性抗原（ESA）的表達（圖3F）。

圖3 在模擬和真實的微重力環境中制備的組織類器官

如上所述，在μG環境中形成的特定組織類型的3D多細胞球狀體表現出包括仿生性、復雜的微觀結構和更小的缺氧面積等生理特性。因此，它們是體外疾病建模和細菌感染及細胞-細胞相互作用研究的理想選擇（圖4）。此外，μG誘導的心臟功能障礙、骨丟失和骨骼肌萎縮已經在μG平臺上使用體外組織模型進行了研究。相關研究利用在μG平臺上制作的組織模型，研究了甲狀腺、肺和腸等器官的非微重力相關病理。

圖4 利用微重力平臺作為工具研究人體的病理狀況

目前，已有研究人員利用A549肺上皮細胞與微珠共培養的類器官在旋轉壁血管（RWV）中形成了結實的3D聚集（圖5A）。感染表達GFP的銅綠假單胞菌后，球狀體顯示綠色感染區域（圖5B）。HCT-8細胞系的類器官在RWV中培養后顯示出柱狀上皮樣結構，并表現出細小隱孢子蟲局部感染（黑色箭頭）（圖5C、D）。在RWV中制備的肝腫瘤類器官顯示在2周時HCT-116結腸癌細胞（紅色）的增殖（圖5E）。在用激動劑BIO或拮抗劑XAV939調節WNT通路后，HCT-116細胞的增殖發生了明顯的變化，說明WNT通路影響HCT-116的增殖（圖5F）。

圖5 在s-μG環境中制備的組織類器官的代表性病理研究應用

此外，更多組織類型的微生理系統正在被應用于許多正在進行的空間生物學項目中（圖6）。這些被資助的項目包括不同組織類型的應用，如hiPSC衍生的工程心臟組織、腎臟近端和遠端小管組織芯片、人類骨骼肌模型和人類血腦屏障芯片等。

圖6 已在ISS美國國家實驗室飛行的代表性組織芯片

綜上所述，該論文總結了微重力用于有、無支架的各種細胞類型的3D構建。除了可以產生模擬微重力和不同支架類型的生物反應器外，這些細胞系本身也可以被認為是選擇其特定生成潛力的工具。干細胞由于其多能性，通常最有利于3D結構的形成。通過在微重力模擬平臺上共培養多種細胞類型，也可以形成更大的仿生結構，為個性化醫學和病理研究提供更精確的模型。雖然微重力已被證明可以增強類器官的形成，但抑制球狀體形成的矛盾結果也存在。這可能歸因于使用了不同的方案，包括支架的大小和培養時間。然而，某些組織類型的發展，特別是肌肉組織，可能會因微重力改變的機械感應途徑而變得復雜，這使得這些平臺可能在研究這種病理機制方面更加有用?？偟膩碚f，空間醫學生物學的研究加強了對推進再生醫學領域的努力。隨著人類繼續冒險進入“最終前沿”，研究人員也必須繼續探索生物醫學科學和生物工程的新前沿。

審核編輯：劉清