先進等離激元技術及其在多尺度生物醫學成像中的應用

成像技術對于破譯各種空間尺度的生物現象、結構和機制至關重要。傳統成像方式的空間分辨率不能滿足生物醫學領域高精度研究和診斷的需求。等離激元共振是光與物質的相互作用，它使遠場輻射聚焦到近場，形成局域化的強電磁場，增強了納米消融、吸附物的彈性/非彈性散射和附近熒光體的光致發光發射。

此外，納米粒子的等離激元共振散射可以靈敏地反應微環境的變化。將等離激元的高空間分辨能力與拉曼、紅外、熒光等分子光譜分析技術相結合，可以發展出一系列優秀的成像技術，實現從組織到亞細胞水平的各種生物過程的實時監測。

近期，廈門大學李劍鋒教授與廈門大學附屬心血管病醫院王焱教授從空間分辨率的角度綜述了一系列等離激元技術的原理，并展開論述其在生物醫學成像領域的應用。相關成果以“Advanced plasmonic technologies for multi-scale biomedical imaging”為題發表在國際化學權威雜志Chemical Society Reviews上。



圖1 不同尺度空間分辨等離激元技術在生物成像中的應用

等離激元光子學的基礎

圖2 等離激元的機理和現象

作者首先簡要介紹了等離激元光子學的基本概念，并強調了局域等離激元共振效應（LSPR）的納米尺度的特點，引申介紹了三個LSPR相關的現象：

（1）金屬表面附近的電磁場增強。在局部等離激元共振狀態下，電磁場延伸到周圍大約10 nm-30 nm，因此，它只能影響附近的物體，例如，增強表面吸附分子的拉曼（非彈性）散射，增強金屬附近熒光團的熒光發射，以及在納米區域消融/電離樣品。這種局部的電磁場使得探測納米區域的信號成為可能。

（2）納米結構的加熱效應。一旦局部表面等離激元被激發，吸收的能量就會誘導金屬的電子從基態轉移到高能態，產生熱載流子。一小部分熱載流子通過光致發光或能量轉移到周圍介質而衰變。而大多數作為阻尼振蕩器，通過電子-光子、電子-電子和電子-聲子的耦合進行非輻射衰減，導致局部熱效應。這種熱能可以作為納米級的熱源用于光熱解吸、光熱治療和材料合成。

（3）納米結構奇特的散射和吸收效應。當納米粒子中電子振蕩的頻率與入射光的頻率相吻合時，入射光子就會發生顯著的消光，包括散射和吸收，因此納米粒子溶液顯示出獨特的顏色。不同尺寸的納米粒子表現出不同的吸收/散射行為。吸收/散射譜圖的變化反應了納米粒子之間以及納米粒子與周圍環境的相互作用，這為埃級距離變化的傳感提供了一種有效方式。

LSPR提供了適合于納米尺度成像的超敏感分析方法。上述增強的拉曼和熒光效應可以衍生為表面增強的拉曼散射光譜（SERS）和針尖增強的拉曼/熒光光譜（TERS/TEFS）。等離激元材料的增強電磁場和加熱效應可以發展為針尖增強的燒蝕和電離質譜（TEAI-MS）。彈性散射可以發展為散射型掃描近場光學顯微鏡（s-SNOM）和等離激元尺。因此，接下來，該綜述從空間分辨率的角度（即從微米到埃級的分辨率），敘述了以上技術在生物醫學成像中的應用。

SERS生物成像：從微米到納米的分辨率

自1970年代發明以來，SERS技術由于其超靈敏和抗干擾能力而被廣泛用于生物成像和生物感應。目前有三種基于納米結構的SERS檢測方法：直接SERS成像、基于反應的SERS成像和標簽式SERS成像（圖3a-c）。根據SERS生物成像的模式，空間分辨率從微觀到納米不等。所有這些SERS檢測方法都可以適應普通的基于激光的光學系統，以獲得由點掃描、線掃描或面掃描逐像素收集的光譜集產生的SERS圖像。SERS成像的空間分辨率通常受到遠場衍射極限的限制。

SERS成像可以用于研究細胞外、細胞膜和細胞內發生的單細胞生物學過程（圖4）。比如用增強基底對細胞外pH進行成像，利用SERS-標簽策略監測葉酸與其細胞表面受體之間的受體介導的內吞作用，以及用超窄的納米間隙SERS編碼標簽實現活細胞的細胞器成像。

圖3 SERS生物成像的模式

SERS技術還適用于組織水平的可視化、診斷和疾病的預后，如腫瘤和缺血性壞死（圖4）。SERS基底已經成為一種探測組織切片和高靈敏化學成像的表征手段。比如用金納米珊瑚增強基底獲取生物切片的獨特拉曼帶，實現缺血區和正?？刂茀^的顯著區分。

進一步，經過保護性殼層修飾的SERS標簽粒子可以用于圖像引導的外科腫瘤切除和熱成像引導的微腫瘤消融。另外，將SERS標簽與近紅外-II熒光相結合，可以提供了一個雙模式跟蹤平臺，以評估體內化學分布和標記的干細胞的動態。這種標記和多模態追蹤系統在不同器官疾病的治療方面具有巨大的潛力。

上述細胞級成像應用主要受遠場衍射的限制，分辨率在微米/亞微米的量級。而超分辨率SERS成像擴展了納米級成像的可能性，同時還可以獲得豐富的光譜信息（圖3e-i）。為了實現打破衍射極限的更高空間分辨率，可以采用獨特的超分辨率方法（STORM）來獲取和處理信號。

SERS超分辨率成像借鑒于單分子熒光成像技術：當個別分子擴散進入或者離開納米粒子間隙形成的熱點時，會導致SERS強度隨時間發生波動（表現為在微秒或毫秒尺度的寬場圖像中的光閃爍現象）。因此可以利用熱點的這一特征，實現單個分子的SERS散射信號在“開”和“關”狀態之間的不斷切換。

通過SERS-STORM超分辨技術，實現了針對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的化學成像，圖像分辨率小于50 nm。需要指出的是為了獲得具有納米級分辨率的生物樣本的SERS超分辨全景成像，通常還需要高密度和大面積的熱點，作為納米級的激發源，隨機“照亮”生物樣本表面的分子。

圖4 SERS細胞成像和組織成像的應用

針尖增強的燒蝕和電離質譜成像：亞微米級的分辨率

盡管二次離子質譜（SIMS）可以提供納米級分辨率的化學成像，但它受到光譜干擾、基質效應和質量范圍的限制。若將近場技術引入質譜分析，質譜成像（MSI）的空間分辨率可以達到亞微米級甚至納米級。研究人員通過引入一個納米級的無孔探頭實現了納米級的MSI。

由于LSPR效應，無孔針尖頂點的輻照度被放大，并作為直接電離的強化光源，使化學成像的橫向分辨率超越了遠場衍射極限限制（圖5）。除了化學信息，在近場方法中使用的針尖可以同時獲得表面的拓撲信息，這對理解復雜的生物性質是一種重要補充。

圖5 針尖增強質譜的成像原理、模式和應用

由于等離激元材料提供了增強的燒蝕作用，MSI系統和針尖增強方法的結合可以實現微米/納米級空間分辨率的燒蝕并提供化學信息。研發人員開發一種離線質譜方法來轉移和分析生物大分子，在分析血管緊張素II時發現了一個直徑為1 μm的燒蝕坑。近場針尖增強的ICP-MS可以在葉子和花瓣上進行單次測量，橫向分辨率為300 nm。此外，將掃描隧道顯微鏡（STM）與自制的反射光飛行時間質譜儀結合起來，可以以50 nm的橫向分辨率對KI殘留物的圖案進行成像（圖5）。

針尖增強的納米光譜成像：納米級的分辨率

掃描探針顯微鏡（SPM）可以獲取單分子的原子級分辨率圖像，然而獲得的化學信息有限。相比之下，光譜工具提供了獲得分子的振動/電子信息的機會，因此可以進行化學分析鑒定。但是光譜技術的成像空間分辨率是由半波長衍射極限（>200 nm）決定的。為了獲得超高空間成像分辨率以及化學結構信息，科學家們將SPM和光譜學結合起來，實現了針尖增強的納米光譜學技術。它在測量生物樣品或納米材料的形態、并同時獲得樣品化學分布和物理特性等方面具有很大的潛力。針尖增強納米光譜成像技術按發展的時間順序可細分為幾種技術：散射型掃描近場光學顯微鏡（s-SNOM）、針尖增強拉曼光譜（TERS）、針尖增強熒光光譜（TEFS）和同步針尖增強拉曼和熒光的雙模式（TERS-TEFS）。

s-SNOM借助原子力顯微鏡（AFM）的空間分辨率提供樣品表面的化學和光學特性信息（圖6）。s-SNOM的發明大大促進了納米級生物成像技術的發展。例如通過配備寬帶紅外光源，利用金涂層針尖掃描單個包膜病毒可以追蹤病毒破裂過程中的細微結構和指紋光譜變化。s-SNOM還可以掃描單個蛋白并實現30 nm橫向分辨率的圖像。獨特的吸收光譜表明，胰島素的二級β-折疊結構被外部的α-螺旋結構所包裹（圖6）。

圖6s-SNOM、TERS原理及生物成像應用

TERS為探索生物組織的超分辨拉曼散射提供了機會。例如，TERS可以識別蛋白質的結構和特定官能團的比例，并獲得用于測序的無標簽DNA或RNA信號（圖6）。TERS可以獲得納米區域內的胰島素纖維的特征信號。高空間分辨率的光譜顯示，只有34%的纖維素表面是純β-折疊，其余的由α-螺旋和無序結構部分組成。TERS已被用于DNA研究，如測序和監測DNA鏈的斷裂過程。在超高真空（10-10 torr）和低溫（80 K）的環境下，通過配備光學低損耗的銀尖端，TERS掃描可以將腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）堿基氫鍵網絡的分辨率進一步提高到亞納米水平。

針尖增強熒光光譜（TEFS）幾乎與TERS同期發展。與拉曼光譜不同，熒光光譜可以提供有關材料的電子特性和光激發狀態的弛豫動態的信息。TEFS的實現方式（圖7）與TERS相似，而增強效應的規則并不相同。在熒光增強和淬滅之間存在著一種競爭性的效應。比如在垂直方向上，偶極子發射器金屬表面上的球形納米粒子模型系統中，熒光速率經歷了從增強到淬滅的轉變。熒光增強在距離z～5 nm時達到最大值（圖7）。

圖7 基于等離激元材料，制造s-SNOM針尖以獲得更強的信號

先進的近場技術可以實現亞衍射極限的成像。比如利用孔徑上的尖端策略可獲得空間分辨率為26 nm ± 4 nm的細胞成像。光學納米天線可以清楚地分辨出其原生環境中的蛋白質，增強熒光圖像的空間分辨率為50 nm。另外，無孔針尖可以觀察小分子和蛋白質之間相互作用的更多細節。熒光標記DNA的針尖增強全內反射熒光顯微鏡（TIRFM）和AFM成像聯用，可實現39nm的空間分辨率。理想條件下，利用銀尖端的單個原子和NaCl層隔離的銀基質，可以以0.8 nm的空間分辨率對單個酞菁分子進行成像。這些概念性研究的成功為推動TEFS以超高空間分辨率獲得復雜生物體系成像奠定了基礎。

TERS用于獲得分子的化學鍵振動信息，而TEFS可以獲得分子的電子轉移動力學信息。這兩種技術的結合可以在同一臺儀器上實現，被稱為TERS-TEFS，以實現更全面的材料表征。針尖增強的近場光學技術實現了高對比度和高空間分辨率（17 nm）的有機半導體薄膜（diindenoperylene，DIP）的圖像，拉曼指紋出現在熒光背景的頂部，表明目標分子是直立的。此外，TERS-TEFS技術可用于同時獲得單層卟啉分子的振動信號和激發態能量衰減路徑。盡管被廣泛用于材料應用，但TERS-TEFS中使用的貴金屬針尖在實際系統中很容易被污染，導致光譜干擾。

使用殼隔絕的針尖在屏蔽干擾的同時，可獲得增強且重復性好的拉曼和熒光信號，二者的相對強度可以通過包覆不同厚度的殼層來調節。在實踐中，熒光背景可能會影響拉曼信號，也就是說主要的拉曼帶位于寬闊的熒光峰區。為了解決干擾問題，作者介紹一個整合兩個激光設備的想法，在針尖共聚焦光譜系統中研究R6G分子，其中一個532 nm的連續波激光用于激發分子熒光，一個632.8 nm的He-Ne激光用于激發拉曼信號（圖7）。將針尖-樣品的距離優化為2 nm，使得拉曼區遠離熒光區，巧妙地避免了相互干擾。

等離激元/分子尺：納米/埃米尺度分辨率

等離激元尺由兩個納米粒子和它們之間的連接物組成。其原理是基于測量與粒子間的距離有關的等離激元共振吸收峰位置的移動或顏色的變化（如圖8）。例如，在引入另一個生物分子時，由生物分子（如DNA鏈）連接的金納米粒子二聚體的距離發生了變化，導致等離激元譜共振波長的急劇變化。暗場散射光譜反映出“侵入”生物分子的特性。等離激元尺包含成對的納米粒子，可以準確測量和分析單個生物分子的特性，包括距離變化和生理化學特性。

圖8等離激元尺的原理和生物成像應用

等離激元尺可用于動態觀察體外DNA分子的生物物理過程（圖8）。比如使用金納米粒子衛星等離激元尺系統，通過核心粒子周圍的肽連接，可以觀察到活細胞中單個生物分子的長時間變化軌跡。此外，等離激元尺還可以研究蛋白質的活性以及研究DNA在酶作用下的彎曲和斷裂過程。雖然一維等離激元尺可以研究亞納米尺度的生物分子的基本參數，但不利于全面了解軟物質運動/反應過程。而通過電子束光刻和逐層納米堆積技術構建的"H型"結構，具有尖銳的散射光譜。任何輕微變化（埃米尺度）都可以產生可觀察到的光學信號，從而實現高分辨率的傳感。

作者進一步設想，生化連接物可以連接這些三維等離激元尺進行生物測量。例如，三維等離子體標尺可以在不同的位置附著在大分子上，如DNA/RNA鏈或蛋白質，然后在暗場顯微鏡下測量光散射光譜，以解析目標分子的構象結構。

圖9 分子尺的原理和應用

金納米粒子上用雙鏈DNA構建的等離激元尺，可以用它來測量由各種內切酶定制的DNA的長度或堿基對的數量（圖9）。暗場散射譜以亞納米的軸向分辨率記錄了金納米連接物的等離激元共振波長與DNA長度之間的關系，顯示每個DNA堿基對的平均波長變化約為1.24 nm。若是將一系列具有R6G染料修飾的dsDNA分子尺連接到Au納米粒子上，可以觀察到距離相關的SERS現象，可用于探明與距離相關的生物過程（圖9）。另外一種帶有探測分子的分子尺，即紫羅堿基團沿著骨架鏈在不同的分子位置上移動（圖9），可以用來分析光學納米腔內電磁場強度的不均勻性，空間分辨率為0.2 nm，結果發現電磁場形成了一個梳狀，其強度不均勻，梯度大，遠遠超出預期。

這些分子尺技術顯示了在超高空間分辨率下研究單個實體構象變化的巨大潛力。作者設想將生物分子附著在分子尺的特定位置上并放置于等離激元場中，生物分子的微妙特征將被明確地展示出來。

總體而言，盡管目前有許多臨床測量和成像技術，但由于衍射限制，它們的空間分辨率被限制在亞微米水平。另外，靈敏度不足進一步阻礙了它們在超低濃度傳感方面的應用。等離激元技術正在為具有化學敏感性和空間分辨率的生物成像鋪平道路。等離激元學的基本物理效應，如電磁場增強、等離激元散射和熱效應，支撐起了許多先進技術，包括SERS、TEAI-MS、針尖增強納米光譜（紅外、拉曼、熒光等）和等離激元子/分子尺。這些新興技術可以實現微米、納米、甚至亞納米級別的空間分辨率，可以應用于生命科學的體外和/或體內成像。

然而，為了更深入廣泛的應用于生物體系成像分析，等離激元技術需要進一步發展：（1）實現埃級的超高分辨率，為解開復雜生物分子的微妙動態結構提供幫助；（2）在實驗室內已證實了等離激元技術在生物醫學成像中的可行性，但是還需要技術的進一步發展，在臨床試驗中驗證該技術的有效性；（3）突破單一化的技術模式，發展多模態聯用技術為生物研究和臨床診斷提供完整多層次的圖像信息。

審核編輯：劉清