4Pi熒光超分辨顯微術綜述

作者：郝翔， 李依明， 傅爽， 李旸暉， 許迎科， 匡翠方， 劉旭

20世紀90年代以來，科技的進步突破了光學顯微鏡的衍射極限，使三維超分辨顯微成像技術得以實現。其中，基于兩個對置物鏡的4Pi顯微架構及其超分辨版本的出現是一個重要的里程碑，并在材料科學領域和細胞生物學領域得到廣泛應用。

中國工程院院刊《Engineering》2022年第4期刊發浙江大學郝翔教授研究團隊的《4Pi熒光超分辨顯微術綜述》一文，綜述了4Pi超分辨顯微術的近期進展。文章指出，4Pi超分辨顯微鏡為透明樣品觀測提供了一種能夠突破衍射極限、非侵入、各向同性的三維分辨率的技術手段。針對目標開關和隨機開關兩個主要的4Pi超分辨顯微術版本，文章深入討論了其架構、原理、應用和未來發展趨勢。

一、引言

自1873年Abbe等推導出衍射極限以來，光學顯微鏡的分辨率在接下來的一個多世紀中未能取得根本性突破。然而，對于高分辨率的追求從來就沒有停止。最終，經過不懈努力，科學家在20世紀90年代取得突破。由于衍射極限的存在，可見光波段范圍內的顯微鏡分辨率一直被限制在250 nm以內。超分辨顯微術的出現使得人類終于打破這一桎梏。得益于過去20年超分辨顯微術的進步，現階段已經可以實現在xy平面和沿z軸將分辨率分別提升6~10倍。需要強調的是，超分辨顯微術并非特指某項技術，而是若干種不同技術方案的總稱。但是，無論具體實現方式如何，這些技術在本質上是相通的：各種技術都由光強調制，并且非線性地開關熒光染料分子以實現對熒光輻射的操控，繼而在時間上依次記錄整個觀察區域內的細節。正是由于這些技術能夠提供突破衍射極限的分辨率，才使首次使用光學顯微鏡進行許多生命科學研究成為可能。

由于大部分生物結構都具備三維空間分布，因此，將超分辨率成像擴展至三維水平，可以清晰地顯示這些生物體結構或記錄分子運動。將原有的二維超分辨顯微成像擴展至三維水平有多種技術實現路徑。對于單分子定位顯微術（SMLM），如光激活定位顯微術（PALM）、隨機光學重構顯微術、熒光激活定位顯微術（fPALM）而言，可以采用雙焦面成像或者點擴散函數（PSF）操控的方法；對于以受激發射損耗顯微術（STED）、可逆飽和光學熒光躍遷顯微術為代表的目標開關超分辨顯微術而言，最常用的策略則是同時使用兩個相位板，通過非相干疊加的方式來創造一個三維中空的STED/RESOLFT聚焦光斑。

通過以上兩種技術路徑都可以在理論上獲得無限小的分辨率。然而，在這些不受衍射極限限制的技術中，光的衍射現象實質上仍然發揮作用。然而，無論使用哪種技術，最終能達的分辨率仍然取決于顯微鏡聚焦光斑的銳利程度。這一事實導致的后果便是：相對而言，軸向分辨率的提高比橫向（焦平面內）分辨率的提高更加困難。因此，即使通過超分辨顯微術可以將橫向分辨率提升到20~40 nm，但是同一架構下達到的軸向分辨率仍然比橫向分辨率低（后者約是前者的2.5倍）。

相對而言，各向同性的三維分辨率受到更多青睞；因為各向同性的三維分辨率能夠提供更加自然的視野，并且基于這樣的圖像進行數據分析，得到的結果也更加精確。然而，由于使用單個透鏡只能覆蓋半個球面波波前，除非刻意犧牲橫向分辨率，否則要做到三維各向同性是非常困難的。另外，如果存在一個光學系統，能夠收集焦面之后的另外半個球面波波前，由于對稱性的恢復，系統PSF的形狀就可以（基本上）保持為一個球形?；谏鲜鏊枷?，在20世紀90年代早期，Hell等發明了基于兩個對置物鏡的4Pi顯微鏡。在實際應用中，一個物鏡大約只可以覆蓋65°的半孔徑角，使用兩個物鏡則可以幾乎完整覆蓋整個4 π的立體角（實際應該為2.5 π~3 π）。如圖1所示，在4Pi顯微術中，逆向傳播的兩束相干照明光分別經過兩個對置物鏡在共焦面上聚焦，并產生疊加干涉條紋的PSF。這種實現方式被稱為A型4Pi架構。另一種實現方式，即B型4Pi架構，則通過對置物鏡反向收集熒光信號并讓它們在探測器上發生干涉。由于引入了共焦面附近的干涉，上述兩種方式都可以在軸向上顯著壓縮PSF的尺寸——這也是構成掃描型4Pi顯微鏡的基礎。如果只保證激發光（A型4Pi架構）或熒光（B型4Pi架構）相干，則可以將軸向分辨率提高3~4倍。如果同時使激發光和熒光相干（C型4Pi架構），則可以將軸向分辨率提高約7倍。除此之外，由于4Pi架構可以從兩個方向收集熒光，可收集的熒光光子數可翻倍，最終可以提高圖像的信噪比（SNR）。與之類似，非相干干涉照明圖像干涉顯微術可以被理解為是4Pi顯微術基于相機的寬視場版本：包含兩個對置物鏡，在焦面附近采用駐波干涉作為照明，并以相干的方式收集熒光信號。因此，它的分辨率也與4Pi顯微鏡類似。

圖1. 4Pi顯微鏡的簡化架構與原理示意圖。（a）簡化架構示意圖。（b）在軸向平面（xz平面）內的4Pi顯微鏡PSF。上下兩個物鏡的PSF相干疊加壓縮了整個PSF的軸向尺寸。（c）不同4Pi架構的有效PSF。從左至右：A型架構，激發光相干；B型架構，發射光（熒光）相干；C型架構，兩者同時相干。APD：雪崩光電二極管；BS：50/50分光鏡；DM：二向色鏡；L：透鏡；M：反射鏡；SM：掃描鏡。

4Pi顯微術與超分辨顯微術的結合可以進一步提高系統的三維分辨率，特別是軸向分辨率。與單物鏡版本的超分辨顯微術類似，4Pi超分辨顯微術也可以分為目標開關型（isoSTED、4Pi-RESOLFT）和隨機開關型（iPALM、4Pi-SMS、4Pi-SMLM）兩類，如圖2（a）所示。在目標開關型4Pi超分辨顯微術中，分別來自對置物鏡逆向傳播的兩個波前發生干涉相消，使得STED/RESOLFT聚焦光斑的中央光強極小值區域在軸向得到顯著壓縮［圖2（b）］。因此，熒光信號的發射被限制在焦點附近非常小的區域內。而4Pi-RESOLFT和isoSTED技術的主要區別在于前者主要使用具有可逆開關效應的熒光蛋白（RSFP）來提供超分辨顯微術所需要的亮態和暗態。對于隨機開關型的4Pi超分辨顯微術，軸向分辨率的提高則主要利用算法提取隱藏在干涉條紋中的軸向（z方向）位置信息［圖2（b）］。為了求解位置信息，對于不同的設計可以同時記錄三幅（iPALM）或四幅（4Pi-SMS、4Pi-SMLM）干涉相位圖。

圖2. 4Pi超分辨顯微術的簡化架構和原理示意圖。（a）isoSTED/4Pi-RESOLFT（左）與4Pi-SMLM（右）顯微鏡的簡化架構示意圖。兩種架構在成像時都將樣品放置在物鏡共焦面上。圍繞光路的小圖標顯示出在光路不同位置（由帶圈I?XI號標出）光的偏振態。特別地，在位置VII、VIII和XI處，同一幅圖中的虛線箭頭相對于實線箭頭有π/2的相位延遲，該延遲是由系統中的石英楔造成的。左圖：在isoSTED/4Pi-RESOLFT顯微鏡中，兩束STED光，即STEDxy（橫向）和STEDz（軸向）互不相干并保持垂直的偏振態。兩束光通過一個偏振分光棱鏡（PBS）合束后，再經過一組掃描鏡進入4Pi干涉腔。合束后的光經第二個PBS分束后，在物鏡的共焦點位置分別生成STEDxy（橫向）和STEDz（軸向）損耗光聚焦光斑［如圖（b）從左起第一和第二列所示］。兩個光斑的中央光強極小值（即焦點）位置互相重合，并通過受激發射對熒光發射現象產生各向同性的損耗作用［如圖（b）從左起第三列所示］。這種作用是通過迫使被STED光照射的熒光分子持續性地處于暗態的方式發揮效用的。同時，焦點附近的熒光信號被兩個物鏡反向收集。收集到的熒光光子在一片二向色鏡上發生反射，并最終進入探測器。右圖：在4Pi-SMLM顯微鏡中，熒光光束被一組分束器反復分束和合束，以形成一系列具有不同干涉相位的光波波前。這些光波波前的相互干涉圖樣最終被位于干涉腔之后的相機同時接收。雖然在不同的設計中，具體的光路和探測器的數量不同，但所使用的單分子定位原理都是相通的，即經過干涉條紋調制后的PSF相比原有的PSF含有更多的高頻信息，因此利用4Pi-PSF進行定位計算，所得到的結果可以更加精確。（b）4Pi超分辨顯微鏡中的PSF軸向平面（xz平面）強度剖視圖。從左至右：isoSTED/4Pi-RESOLFT顯微鏡中的STEDxy、STEDz、合并后的STED（紅色），以及有效PSF（綠色）；4Pi-SMLM顯微鏡中相對相位差? = 0、90°、270°、180°時的熒光干涉PSF。為了更準確地描述isoSTED/4Pi-RESOLFT顯微鏡及4Pi-SMLM顯微鏡的各種PSF，在相應圖片的右上角給出了在探測器（APD或相機）上測得的橫向平面（焦平面，即xy平面）內的熒光強度分布。GW：玻璃窗口；HWP：半波片；Q：石英楔；VP：0~2 π渦旋相位板；s/p： s偏振光/p偏振光。

下面將詳細討論4Pi超分辨顯微術的兩種架構和它們的具體應用。需要強調的是，圖像干涉非相干結構光照明干涉顯微術（image interference and incoherent-illumination-interference structured illumination microscopy， I5S）并不在本文的討論范疇。與I5M相比，I5S顯微術在橫向上利用結構光照明，實現了對有效PSF的三維壓縮。但是，從原理上講，I5S顯微術并不依賴任何熒光的開關效應，即該技術既不需要目標開關也不需要隨機開關。這使得I5S幾乎可與任何熒光分子兼容，因此在具體應用上會擁有相當的優勢。然而，也正因為如此，在理論上，I5S相對于寬視場顯微術也僅能將分辨率提高兩倍。為了進一步提高分辨率，則需要在顯微鏡中引入諸如熒光飽和的各種熒光非線性效應。但是遺憾的是，基于熒光飽和的I5S（或稱為“I5SS”）至今仍未實現。

二、基于目標開關的4Pi超分辨顯微術

STED超分辨顯微術是基于1994年提出的理論模型發展起來的。該技術首先于1999年被實現并被用于材料學研究，并隨即在2000年實現了在生命科學領域的應用。自此，STED徹底改變了熒光成像的范式。STED是首個被實現的基于目標開關原理的超分辨顯微術。其基本工作原理是：在某一確定位置，通過熒光發射損耗效應將熒光發射限制在其周圍一個亞衍射極限的區域內。當工作時，一個光強最強點位于中心的激發光斑和一個環形的STED光斑相互嵌套并掃描樣品上的整個成像區域，在此期間，通過一個與焦點共軛的點探測器順次讀取信號并生成最終的圖像。為了提高STED顯微術的分辨率，STED光斑中心點之外的熒光發射都必須得到有效損耗。因此，一個高質量、中央光強為零的環形光斑對于提升STED顯微鏡的表現顯得尤為重要。

過去15年的技術進步已經使STED顯微術邁進了三維成像的新紀元。在眾多具體的實現方法中，基于兩個對置物鏡的4Pi架構，由于可以在軸向生成非常銳利的STED聚焦暗斑而尤為引人注目。雖然其分辨率優勢沒有得到充分的發揮，但是早期的所謂STED-4Pi顯微術已經能夠在焦平面附近提供約33 nm的軸向分辨率。而作為其改良版本的isoSTED顯微術則已能提供各向同性的三維高分辨率圖像［圖2（a）］。為了實現各向同性的三維熒光壓縮，isoSTED顯微術同時使用了兩個光強零點重合的STED聚焦光斑：其中一個用于橫向（STEDxy）壓縮，而另一個則用于軸向（STEDz）壓縮，如圖2（b）所示。通過對兩個聚焦光斑的光強分配進行調節，可以實現PSF大?。捶直媛剩┑木毑倏?。其中，為了生成STEDz聚焦光斑，需要將分別來自于兩個對置物鏡、相向傳播的光波波前在焦平面上完美重合并形成干涉相消。由于單物鏡PSF中的光強和相位對于焦平面高度對稱，干涉相消除了在焦面中央產生一個光強零點外，在焦面上下都會產生一系列周期性分布的光強零點。這些次級光強零點會與激發光和探測光（熒光）PSF相重合。由于在這些次級光強零點附近，STED光沒有熒光發射損耗能力，進而造成熒光信號泄漏，最終產生了有效PSF中的旁瓣，并造成使圖像質量明顯惡化的軸向“鬼影”（ghost images）現象。更為嚴重的是，當使用這樣的有效PSF掃描整個樣品時，由于上下光路光程差的存在，PSF中的光強極大值點會在PSF的包絡下產生軸向飄移。因此，任何試圖使用一成不變的PSF進行反卷積運算以消除旁瓣的努力都是徒勞的。理論上，基于可變PSF的反卷積運算可能會減輕“鬼影”現象，但是該方法僅適用于可以精確估計PSF并且圖像信噪比很高的場合（這在現實中都很難做到）。為了消除有效PSF中旁瓣的影響，一種有效的策略是加入離焦量，使兩個物鏡的聚焦光斑產生反向偏移，從而破壞STEDz聚焦光斑中的對稱性。這個策略可以通過使用相位板添加附加相位的方法實現。雖然類似的效果也可以通過直接調節兩個對置物鏡間的距離，從而破壞二者的共焦性的方式實現，但是使用相位板不會造成熒光信號和橫向分辨率的損失。因而相比較而言，使用相位板的策略更加有優勢。與STEDz聚焦光斑類似，STEDxy聚焦光斑也是通過分別來自于兩個對置物鏡、相向傳播的光波前干涉實現的，但需要利用干涉相加而非相消。值得注意的是，雖然與單物鏡系統相比，isoSTED顯微鏡中的STED聚焦光斑光強分布和所使用的總功率都比較接近，但是由于干涉的作用，其峰值光強是使用單物鏡STED顯微鏡的兩倍?；诟倪M版的Abbe公式可知：在這種情況下分辨率大約可以提高倍。

與一般的共聚焦顯微鏡相比，isoSTED顯微鏡的熒光光斑大小大概只有前者的1/1500，意味著isoSTED顯微鏡的三維分辨率可以達到20~50 nm。不斷增強的成像能力使得isoSTED顯微鏡成為專門針對透明樣品進行納米級三維成像的強大平臺。迄今為止，isoSTED顯微術已在多個領域得到了廣泛應用。在其發明后不久，一臺isoSTED顯微鏡就被用于材料科學領域對微結構的自組裝效應進行研究。這些結構由嵌段共聚物系統［苯乙烯-嵌段-2-乙烯基吡啶，圖3（a）］形成，其中的乙烯基吡啶被Atto 647N特異性標記，以提供熒光對比度。當共聚焦顯微鏡無法完全分辨時［圖3（b）］，相關細節在isoSTED顯微鏡下得到完美呈現［圖3（c）］。特別是，除了表面信息外，isoSTED顯微鏡還提供了一種非侵入式的成像手段，用于展現樣品的內部的三維形貌，而這種成像能力是之前電子顯微鏡所無法提供的。

圖3. isoSTED顯微鏡在材料科學中的應用。（a）透射電鏡（TEM）下所展現的溶劑退火薄膜的層狀結構。（b）相同樣品在共聚焦顯微鏡下的成像結果，未顯示任何細節。（c）在isoSTED顯微鏡下層狀結構得到清晰展現。圖中標尺：500 nm。經American Chemical Society許可，轉載自參考文獻，2009。

除了在材料科學領域的應用外，isoSTED顯微術的重要性在細胞生物學領域也得到體現。線粒體是一種在能量產生過程中起重要作用的細胞器，是isoSTED顯微鏡的第一個成像目標。正如20世紀50年代電子顯微鏡（EM）所顯示的那樣［圖 4（a）］，在isoSTED顯微鏡下，線粒體也顯示由兩種不同的膜包圍，且其直徑為200~400 nm。isoSTED顯微術的發展使科學家能夠分析納米級生物結構。通過對整個線粒體中直徑約35 nm的PSF掃描成像，isoSTED顯微鏡成功繪制出F1F0-三磷酸腺苷合酶（ATPase）［圖4（b）］和線粒體外膜轉位酶20（TOMM20）［圖4（c）］ 的分布。在另一個應用中，科學家專注于突觸小泡，突觸小泡是神經元細胞中一種平均直徑為39.5 nm的低電子密度泡狀結構。這些突觸小泡位于神經元突觸前末端，用于儲存神經遞質，對于在神經元之間傳播神經沖動至關重要。受益于isoSTED顯微鏡的能力，科學家還成功對海馬體周圍活動區表面池的空間分布進行成像。

圖4. isoSTED顯微鏡在細胞生物學中的應用。（a）線粒體的直徑示意圖。野生型PtK2細胞中的F1F0-ATPase（b）和TOMM20（c）在isoSTED顯微鏡下的成像結果。本圖經ACS許可，轉載自參考文獻，2009。

盡管isoSTED顯微術的軸向切片成像能力遠強于常規STED顯微術，但對于活體生物學應用來說，其所需要的激光衰減功率仍然過高。為了實現活體樣本成像，科學家進一步發明了4Pi-RESOLFT顯微術。作為isoSTED顯微術的衍生技術，4Pi-RESOLFT顯微術與原版的最大不同在于，使用可開關熒光蛋白（RSFP）取代STED顯微術中常用的熒光染料對樣品進行標記。這種改進使得RESOLFT顯微術尤其適用于活體細胞成像，原因是RESOLFT顯微鏡需要的激光衰減功率通常要比常規STED顯微術低兩個數量級，進而實現對可開關熒光蛋白的操控。

三、基于隨機開關的4Pi超分辨顯微術

SMLM的光學分辨率已經達到幾個納米，因此能夠對納米生物結構進行光學分析。SMLM利用寬視場激發和探測來隨機激發和精確定位單個分子，從而實現超分辨能力。由于SMLM易于在傳統的寬視場顯微鏡中實現，因此這種方法目前被廣泛使用。通常通過評估PSF的橫向信息和形狀來實現3D-SMLM?；蛘?，亦可以通過同時對多個焦平面成像來獲得單分子的軸向位置。取決于探測的不同光子，這種技術可以實現20~30 nm的橫向分辨率，而獲得的軸向分辨率相對來說略低。

與傳統的單物鏡3D-SMLM系統相比，4Pi-SMLM通過利用由兩個對置物鏡所檢測的熒光信號的干涉來顯著提高軸向分辨率。兩個對置物鏡通過收集幾乎完整的球面波波前，使孔徑角增加并使探測到的光子數量加倍。此外，當兩個軸向成像光路的光程長度在相干長度內時，重疊兩個探測光路會導致單個光子的自干涉。隨后同時記錄單個分子的三個或四個不同干涉相位圖。由于干涉相位對熒光團的軸向位置高度敏感，利用4Pi-SMLM得到的軸向分辨率比使用單物鏡系統獲得的軸向分辨率高6~10倍，在某些情況下甚至超過了橫向分辨率。

單物鏡納米顯微鏡的軸向分辨率可達約60 nm，但需要使用明亮的合成熒光染料。使用較暗的熒光蛋白（FP）獲得的表現通常較差。相比之下，理論上4Pi-SMLM通過在每個物鏡中收集單個熒光團的250個光子便可實現亞10 nm的三維分辨率。因此，4Pi-SMLM適用于成像被更暗的光活化熒光蛋白（PA-FP）標記的生物樣品。特別是在活體細胞成像中，內源性表達的PA-FP相對于合成熒光染料有幾個關鍵優勢：它們可以被更溫和地固定，并且細胞可以被重新置于生理性培養基中。與合成熒光染料相比，熒光蛋白不需要除氧成像緩沖液和可能引起干擾的清潔試劑或處理來控制單分子的光物理特性。

即使使用熒光信號更暗淡的PA-FP，4Pi-SMLM的三維分辨率仍可以達到小于20 nm，從而使生物學家能夠在三維空間更清晰地觀察生物樣品的細節信息。細胞外基質和肌動蛋白細胞骨架的細胞黏著斑（FA）的連接在形態建成、免疫和傷口愈合中至關重要。在細胞邊緣突出期間，FA形成小于250 nm的簇狀整聯蛋白、FA激酶和樁蛋白。FA的多層蛋白質結構對于理解其功能至關重要。對于FA中不同蛋白質復合物的三維結構成像，最理想的方法是，將4Pi-SMLM與用PA-FP標記的FA結合。利用4Pi-SMLM的三維各向同性的納米級分辨率能力，Kanchanawong等發現在不同大小和形狀的FA中，每個FA成分的軸向分布高度一致，表明蛋白質在FA中的位置可調節其活性和功能。Case等則使用類似的策略調節黏著斑蛋白的激活和功能。

此外，對于許多不同生物系統，特別是那些需要超高分辨率的生物系統，4Pi-SMLM還提供了深刻的定量生物學闡釋。轉運所需的內體分選復合物（ESCRT）的納米級結構［被人類免疫缺陷病毒（HIV）劫持］已經在病毒出芽點被4Pi-SMLM解析。ESCRT亞單位的空間結構表明，HIV釋放的驅動力可能來源于病毒芽內部ESCRT亞單位的初始支架。兩個離散的桶狀結構（每個桶狀結構由幾十個單獨的Nup188簇組成）也被4Pi-SMLM在細胞纖毛基底位置成功解析。這種結構特征證明了Nup199將中心粒包裹在桶狀結構中的假說。此外，三維的4Pi-SMLM圖像被用于量化分泌機制中蛋白質的數量。Zhang等展示了分泌系統中PrgH蛋白在細菌細胞膜附近形成的各種大小的三維分子簇（圖5）。最近，4Pi-SMLM也已被成功用于解析異質納米級交聯的三維組織，為微凝膠形成動力學提供了深刻的見解。

圖5. 使用4Pi-SMLM對不同生物樣品進行超高分辨率三維成像。（a）由細菌細胞膜附近的分泌系統蛋白PrgH形成的分子簇的三維成像。（b）來自58個細菌細胞的PrgH簇的累積4Pi-SMLM圖像。本圖經National Academy of Science許可，轉載自參考文獻，2017。

除了在生物學和材料科學領域的應用，4Pi-SMLM在其他領域也得到不斷發展，目前也具備越來越高的成像能力。當4Pi-SMLM概念被首次實現時，成像深度被限制在一個干涉周期內（發射波長的一半，約250 nm）。這是因為干涉光強是周期性的，屬于相鄰干涉條紋的光強峰值無法被區分。兩種方法可以解決上述問題：第一種方法是在4Pi-PSF中引入像散。因此，PSF的整體形狀可以用于展開不同周期中的干涉相位，從而將成像深度擴展到與基于散光的3D-SMLM方法所能提供的同樣深度（約1 μm）。第二種方法基于發射的波前是球形的而非平面的概念，利用第零中心矩和第三中心矩的光強振蕩不同的特點，精確地定位不同周期中的z位置。最近，自適應光學已經被引入4Pi-SMLM，從而實現了全細胞成像（圖6）。此外，多色成像也被引入4Pi-SMLM。第一次雙色4Pi-SMLM成像的實現是通過發射光中的s偏振光與p偏振光的比率來判定熒光團顏色。最近，利用由激發二向色鏡反射的回收熒光實現了三色4Pi-SMLM成像。另一個令人興奮的進展是4Pi-SMLM和電子顯微鏡的關聯成像。4Pi-SMLM的高分辨率和高分子特異性與電子顯微鏡結合大大縮小了熒光顯微鏡和電子顯微鏡之間的分辨率差距，實現了熒光信號與電子顯微鏡圖像更好的重疊。

圖6. 小鼠精母細胞聯會復合體的4Pi-SMLM成像。（a）利用21個光學切片重建的全細胞的整體圖像。精母細胞內部頂部（b）和底部（c）位置的4Pi-SMLM圖像。（d）（a）圖中的x—z視圖。本圖經Elsevier許可，轉載自參考文獻，2016。

用于單物鏡3D-SMLM的理論極限精度已經可以通過基于熒光球的實驗PSF模型和極大似然估計來實現，然而傳統的基于相對光強的4Pi-SMLM的數據分析方法并不能達到理論分辨率極限。這是因為基于相對光強的方法并沒有利用條紋狀干涉4Pi-PSF中的高頻信息來提升分辨率。三次樣條插值的相位恢復的4Pi-PSF模型的開發，使得4Pi-SMLM可以達到理論分辨率極限。然而，由于4Pi-PSF本質上是四維的（x、y、z和相位），簡單的多通道三維PSF模型不適合用于描述4Pi-PSF。Li等最近提出的4Pi-PSF模型將4Pi-PSF的三維位置和相位項進行解耦。他們不直接使用四維4Pi-PSF模型，而是通過三個三維矩陣和一個簡單的相位項的結合來完整描述四維4Pi-PSF，使得四維4Pi-PSF的實驗校準在實踐中易于實現，從而發揮4Pi-SMLM的全部潛力。

四、討論與展望

利用熒光的特異性標記能力，光學超分辨顯微術已被證明是一種用于在亞細胞結構中探尋分子細節的有效方法。相關技術仍然在不斷發展，以期提供多色、三維、活體細胞成像的納米級顯微成像能力。針對本文之前的討論，圖7給出了4Pi顯微術的技術演進路線?，F階段，大多數超分辨顯微術已有能力提供50~100 nm的空間分辨率。然而，如果空間分辨率能夠在此基礎上進一步提升一個數量級，那么生物學家就有望能直接觀察大型分子復合體內的單個分子基團的三維圖像。如果這一夢想得以實現，生物學家就可以對細胞內的分子機制進行原位成像，觀察其結構和分子組成。這種能力對于許多的生物學研究至關重要，例如，在這樣的分辨率下可以對DNA構象進行三維觀察，以理解染色體DNA的包裝和基因調控。在現階段，為了具備這種能力，理論上可以通過在隨機開關納米顯微鏡中，將單個熒光發射器的光子數量增加兩階，或在靶向開關超分辨顯微鏡中將STED激光衰減功率提升兩個數量級。然而，如此高劑量地增加光子數或激光強度，通常不利于實際的生物實驗。相比之下，如果基于雙物鏡4Pi而非單物鏡架構，相同超分辨顯微術在軸向的分辨率幾乎可以提高3~10倍。在此基礎上，進一步將分辨率提高一個數量級，而且不需要滿足熒光標記的嚴格特性或苛刻的成像條件。

圖7. 4Pi顯微術技術發展路線圖。

除了4Pi超分辨顯微術外，其他技術也可能將軸向分辨率提高到亞50 nm的水平。例如，用于納米形貌的點累積成像（PAINT）技術及進一步發展的DNA-PAINT技術便是其中之一。該技術在樣品制備過程中用熒光配體的隨機結合代替了永久結合的熒光團的隨機光活化。另一種通過樣品制備提升分辨率的方法是樣品膨脹顯微術（ExM）。通過使用可鼓脹的聚合物網絡放大樣品，ExM允許研究人員識別其中的微小結構。除此之外，在儀器學發展方面，最小化熒光光子通量顯微術（MINFLUX）是迄今最先進的用于精確定位熒光分子的方法。一般SMLM通過算法定位一幅圖像中稀疏分布的熒光光斑的質心或最強點位置來實現單分子功能，而MINFLUX則通過激發光斑中央的暗斑來進行定位的。除此之外，人工智能技術的發展也為將衍射受限的輸入圖像轉變為超分辨圖像提供了另一種途徑，或者顯著降低了利用超分辨顯微術進行活體細胞成像時的照明光劑量。

到目前為止，這些新興技術的使用效果僅在單物鏡架構的顯微鏡中得到了驗證。值得注意的是，并不存在上述技術無法與4Pi架構兼容的障礙。如果類似的結合一旦成功，人們一樣可以期待它們能夠提供更高的三維分辨率或更好的信噪比之類的技術優勢，就跟目前在isoSTED和4Pi-SMLM顯微術中已經實現的一樣。然而，主要挑戰來自于系統復雜性的增加：4Pi架構除了需要針對這些新興概念進行專門的額外系統優化外，還需要對大量并行參數進行細致的調整。如果處理不當，此類問題會嚴重影響系統性能。事實上，大多數4Pi顯微鏡或超分辨顯微鏡都只能在全球少數實驗室中得到有效維護和使用。為了使更多的非光學專業人士能夠使用4Pi顯微鏡，有必要進一步公開4Pi顯微鏡的設計圖紙、軟件、操作和樣品制備方法，同時，應進一步簡化現有4Pi顯微鏡的設計。令人欣喜的是，科學家已經在這方面取得了顯著進展。例如，在isoSTED顯微鏡的初始設計中，需要兩個獨立的STED激光光束來分別生成STEDxy和STEDz聚焦光斑。顯而易見，如果能夠使用單一激光器作為STED光源，可以有效降低系統復雜度，提高成像過程中的穩定性?；诖?，科學家提出了兩種方案：一種是引入基于空間光調制器的雙反射架構來分別編碼激光光束中兩個正交的偏振分量，從而同時實現STEDxy和STEDz聚焦光斑；另一種則是在光路中插入一個分段的、具有高度波長選擇性的波片元件。兩種設計都已實現并證明其可以有效地實現isoSTED成像。

考慮到4Pi顯微鏡中干涉腔的高度對稱性，一種更為“激進”的策略是完全去除其中一個物鏡，并使用一個反射鏡取代通常用來托住樣品的載玻片。這樣的設計被稱為鏡面輔助分辨率提升技術（MEANS）。在MEANS顯微鏡中，入射光和反射光可以模擬常規4Pi顯微鏡中兩束反向傳播的光束，進而在鏡面上產生局部干涉以限制PSF的軸向尺寸。雖然MEANS的初始設計僅能夠在緊貼鏡面的二維平面內提高軸向分辨率，但是其優越性在于，這種架構可能既可以用于目標開關超分辨顯微術也可以用于隨機開關超分辨顯微術?？傊?，MEANS顯微鏡提供了一種用于提高單物鏡系統軸向分辨率的一般性策略，因此，有望改造許多現有的單物鏡系統，從而以一種虛擬的方式為更多實驗室提供使用4Pi顯微鏡的可能。

由于各類不同的4Pi超分辨顯微術已經實現，相關的理論體系亦已建立完備，下一階段的研究重點將是如何使得相關技術以更好地解決實際的科學問題。不難理解，如果要發揮4Pi雙對置物鏡架構的最大效能，觀察樣品必須是完全透明的。為了在整個成像過程中保持穩定的干涉模式，4Pi顯微鏡對由樣品折射率不均勻引起的像差很敏感。盡管已有少量關于4Pi顯微鏡被用于細胞學研究的報道，但是相關技術在厚樣品的應用還幾乎完全沒有被研究，如生物組織方面。為了實現4Pi顯微術在生物組織中的應用，需要解決樣品像差問題。因此，必須首先建立一個用于描述像4Pi這類具有多個非連續圓形入瞳的顯微鏡像差的數學模型。同時，還需要在系統中引入自適應光學用于對樣品像差的補償。相關的理論已經啟發了一些將4Pi顯微術用于全細胞和組織切片樣品成像的前瞻性工作。雖然致力于將4Pi顯微術用于厚樣品成像的研究工作已經開始，但其全部潛力還遠未被發掘。在這個進程當中尤為關鍵的一步則是如何將4Pi顯微術運用到活體樣品成像中。

審核編輯：郭婷